T-bet修饰的IKDC抗肝癌活性的效应与机制研究

产生干扰素的杀伤性DC（ IKDC）是新近确认并得到广泛关注的一个细胞亚群，其表型既有NK细胞标志，也表达DC标志。IKDC能分泌IFN-γ，同时具备细胞毒性和抗原提呈能力，在抗肿瘤免疫机制研究和肿瘤生物治疗方面具有重要意义。转录因子T-bet具有双重作用，可以激活多种免疫相关分子，促进IFN-γ分泌，同时增强免疫细胞抗原提呈能力和杀伤效应。本课题拟利用慢病毒系统对IKDC进行T-bet基因修饰，以期进一步增强其杀伤效应和抗原提呈能力，通过体外实验探讨T-bet修饰后细胞活化的分子机制；并在SCID-hu-IKDC免疫重建小鼠模型上观察其在体内杀伤肿瘤的效应。本课题通过体内和体外实验，探讨T-bet修饰/IKDC抗肿瘤的协同效应，为深入研究这一兼具杀伤活性和抗原提呈功能的新细胞亚群提供理论依据，也为肝癌的临床免疫治疗和生物治疗领域提供新的思路和重要的实验证据，因而具有重要意义。

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，目前除手术外缺乏其他可靠的治疗手段，整体愈后极差，探索对原发性肝癌发病机制的研究并寻找相应的治疗方法具有重要的意义。然而，近年来在小鼠体内发现了一群新的细胞亚群--产生干扰素的杀伤性DC (Interferon-producing killer DC, IKDC)，在功能上，IKDC能分泌IFN-γ，具有细胞毒性，同时还具备抗原递呈能力。此发现为研究肿瘤免疫治疗提供了一个新的途径，也为肝癌的临床免疫治疗和生物治疗开辟了新的领域。. 本研究通过构建表达小鼠T-bet基因的慢病毒载体，转染293T细胞获得包装病毒，采用MACS结合FACS进行IKDC的分离和鉴定， 以T-bet慢病毒感染新鲜分离的IKDC细胞，建立T-bet修饰的IKDC短期培养细胞株（T-bet-IKDC），检测T-bet-IKDC分泌IFN-γ水平上调表达。然后将T-bet-IKDC肝癌细胞共培养，结果表明T-bet-IKDC对肝癌细胞有明显的抑制效应，T-bet-IKDC细胞膜表面凋亡相关分子TRAIL、NKG2D水平上调表达。. 成功构建SCID-hu-T-bet-IKDC/SCID-hu-IKDC小鼠肿瘤移植模型，在体内实验模型分析T-bet-IKDC抗肿瘤活性，定期观察测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线呈抑制趋势；Western-Blot检测小鼠荷瘤组织相关凋亡因子Caspase-3、TRAIL、NKG2D、Fas-L、perforin、Granzyne-B，表达水平均较对照组上调。.　　我们试图在人血液细胞中分选人类IKDC样细胞，经两次分选后细胞培养效果欠佳，等待后续研究中进一步探索人IKDC样细胞杀伤肝癌细胞。.　　综上所述，本研究通过对IKDC转染获得T-bet-IKDC，探索了T-bet-IKDC体内、体外杀伤小鼠肝癌细胞的新方法，进一步分析了IKDC在抗肿瘤免疫中的作用机制，为T-bet-IKDC应用于肝癌免疫治疗提供新的实验依据，为今后的临床应用奠定基础。虽然本实验未能培养出人IKDC样细胞，但本课题组仍会继续与国内外同行增进交流，探索人IKDC样细胞相关研究。