利用Tbx1相关发育调控通路探索中医耳-肾学说的分子基础

耳-肾学说是中医治疗听力下降、听觉障碍等疾病的依据。一系列的临床观察，包括氨基糖苷类药物的耳毒性及肾毒性、Alport综合征所表现的肾小球损害及听力丧失、先天畸形综合征常常同时涉及耳和肾两个器官等均提示上述学说具有物质基础。近期国外研究发现Tbx1基因的缺失可导致小鼠内外耳的发育缺陷。在前期实验中，申请者发现在鼠胚肾组织中亦存在Tbx1和Hoxd10基因的表达，且二者具有相似的变化趋势。免疫共沉淀、质谱分析和Western印迹杂交实验证实二者的蛋白产物亦存在相互作用。在此基础上，本研究拟采用酵母双杂交实验进一步确定二者的保守性结合区；通过基因过表达与RNA干扰观察二者对于胚胎组织生长的影响，结合差异显示实验探索二者参与调控的信号通路，并对其下游靶基因进行预测和验证，最后利用转基因动物证实二者对于肾脏及耳发育的影响。通过阐明耳、肾发育所共有的分子通路，为揭示中医相关学说的物质基础提供依据。

本课题主要从TBX1基因入手探索中医耳-肾学说的分子基础。首先，我们通过对TBX1与HOXD10基因启动子区序列的分析，发现二者作为转录因子可能彼此相互作用。通过免疫共沉淀、RT-PCR以及Western blotting实验，我们证实在肾细胞中存在二者的相互作用，且后者可通过TGF-β/BMP通路调控肾脏的发育（Fu et al., 2012）。为了更为系统地揭示耳和肾脏所共同拥有的分子机制，我们用庆大霉素制作了氨基糖甙类药物耳、肾毒性的大鼠模型，并用Affymetrix Genechip Rat 230 2.0芯片对新生大鼠的内耳、肾以及肝组织中约24000条基因的表达进行了分析，发现13个基因或基因家族在肾脏和内耳中的表达在给药前后呈现一致的变化。从中我们选择了Ifi44（microtubule-associated protein 44, member of type I interferon-inducible gene family），并利用实时PCR、Western印迹、免疫组化等实验证明给药组大鼠的耳蜗和肾实质中Ifi44表达显著增强，同时伴随免疫细胞的显著增加。鉴于ifi44与狼疮性肾炎的相关性以及在内耳中的表达，上述结果提示Ifi44很可能在庆大霉素诱导的耳及肾毒性中扮演重要的角色，可能参与形成中医耳、肾学说的分子基础。此外，我们还选择了CHOP（C/EBP-homologous protein）基因，并利用实时PCR、Western印迹、免疫组化以及TUNEL标记法，证明CHOP在给药组大鼠耳、肾中的表达均升高。给药组中出现了TUNEL阳性细胞且CHOP表达为阳性，提示庆大霉素的耳、肾毒性也可能涉及内质网应激介导的细胞凋亡信号转导途径。利用经过清理的OMIM数据，我们还构建了支持表型比对的Phenomim二级数据库，并用其来预测基因的相互作用。对中医理论与先天性疾病以及胚胎发育学对应关系的系统整理，也以专著的方式得到出版（《从DNA到中医》，北京：科学出版社，2012）。在后续的研究中，我们将整合表型预测与基因表达芯片分析的结果，从mRNA、蛋白质以及组织学的角度验证更多的基因，力图系统地揭示相关中医学说的分子基础。在项目的资助下，本课题的研究已发表SCI收录论文5篇、ISTP收录的国际会议摘要2篇、中文核心期刊论文1篇、出版专著1本。