不同衰老型牡丹叶片的比较蛋白质组学研究

Peony is a potential candidate of national flower, which is the symbol of wealth and good fortune. This project focuses on the identification of key proteins controlling senescence process of peony leaves by comparing the proteomics of peony leaves from early senescence variety Roufurong and late senescence variety Juanyehong, respectively. The following studies will be carried out: (1) Determining the senescence process of peony leaves by analyzing the ultrastructural, physiological, and biochemical differences between two varieties during natural senescence. (2) Isolating differently expressed proteins by comparing leaf proteomics of two different varieties for total leaf protein, chloroplast protein, and thylakoid membrane protein during the different periods of natural senescence using 2D-DIGE and BN/SDS-PAGE. (3) Identifying the key proteins controlling senescence process of peony leaves by cloning genes coding for differently expressed proteins, detecting genes transcriptional level, and performing bioinformatical analysis. This project will not only contribute to the better understanding of the molecular mechanisms of senescence in peony leaves, but also provide a scientific basis to molecular breeding designed to cultivate strong seedlings and improve flowering quality.

牡丹是待定的国花，是富贵吉祥的象征，本项目以牡丹早衰品种肉芙蓉和晚衰品种卷叶红的叶片为研究对象，通过比较蛋白质组学的方法，鉴定在牡丹叶片自然衰老中发挥关键作用的蛋白。具体研究内容包括：在分析2个品种叶片自然衰老的生理、生化和显微结构差异的基础上，确定衰老的发展进程；通过2D-DIGE、BN/SDS-PAGE等手段，比较2个品种在叶片自然衰老不同时期叶片总蛋白、叶绿体总蛋白、类囊体膜蛋白的表达差异，并对具有重要生理意义的差异蛋白开展基因克隆、转录水平表达、生物信息学分析等的功能研究，明确牡丹叶片中关键的衰老相关蛋白。本项目的研究不仅对理解牡丹叶片衰老的分子机理具有重要的理论意义，而且对牡丹的壮苗培育和开花质量的提高也能提供有价值的信息。

叶片的衰老是一个极为复杂的生理生化过程，本项目以牡丹早衰品种肉芙蓉和晚衰品种卷叶红的叶片为研究对象，进行了叶片衰老的蛋白质组和转录组的有益探索。主要结果如下：（1） 肉芙蓉为叶片早衰型牡丹，卷叶红为晚衰型牡丹，叶片诱导衰老期间测定POD酶活，肉芙蓉酶活从870(U/g.min)降到543(U/g.min)，卷叶红酶活从460(U/g.min)升到了1336(U/g.min)；进一步测定SOD酶活，肉芙蓉酶活从106(U/g.min)变化到 102(U/g.min)；卷叶红酶活从104(U/g.min)降到了53.7(U/g.min)，接着又升到了111(U/g.min)；另外，测定了衰老期间两品种H2O2含量变化，发现肉芙蓉叶片H2O2从0.56上升到 3.928，即暗诱导衰老期间H2O2显著上升；卷叶红酶活从2.34降到了1.47，上述结果的差异可能和两个品种衰老的特性不同有关。（2）牡丹叶片暗诱导衰老过程中，内肽酶活力在暗诱导72h之前呈上升趋势，在72h之后开始下降，表明内肽酶在牡丹叶片衰老过程中扮演着重要的角色。（3）肉芙蓉和卷叶红叶片衰老过程中蛋白质含量和叶绿素的含量均呈下降趋势，但卷叶红下降慢于肉芙蓉。（4）牡丹衰老过程中叶片的解剖结构显微观察发现，叶片组织结构逐渐疏松，细胞轮廓逐渐模糊，叶片中叶肉细胞内的叶绿体以及气孔保卫细胞中的叶绿体的数量也呈下降趋势，并且部分气孔保卫细胞呈关闭状态。同时发现卷叶红叶片中叶绿体的衰减情况慢于肉芙蓉的叶片。（5）肉芙蓉和卷叶红自然衰老期间牡丹叶片转录组和蛋白质组测序，得到了有效RNA-seq数据共2.09亿条，数据量19.37G，平均长度92.2bp；每个样本测序数据量都在5G以上，满足后续转录组分析需要；蛋白质组iTRAQ测序共获得447192个二级谱图，能匹配到16603个多肽上，鉴定到3755种蛋白。发现了众多衰老差异相关蛋白，主要和活性氧、蛋白质降解、代谢物质运输、植物激素、叶绿素降解、氨基酸转移等途径有关。（6）选取其中差异显著可能起关键作用的衰老相关基因，包括ＳＯＤ基因、乙烯信号转导中的EIN2及EIN3基因、seed maturation protein基因、线粒体上的NADH还原酶基因、HSP90、HSP17.5、WRKY抗逆转录因子等进行植物转基因功能分析，实验还在进行当中。