lncRNA HIF1A-AS1调节深静脉血栓血管内皮细胞凋亡与增殖的作用和机制研究

Deep vein thrombosis (DVT) is of great harm and unclear pathogenesis, in which apoptosis of vascular endothelial cells (VECs) plays a key role. Our previous research established a model of apoptosis of VECs in vitro and found that HIF1A-AS1 was the most notable lncRNA. After silencing HIF1A-AS1, we found that it reduced VECs apoptosis and promoted proliferation, suggesting that HIF1A-AS1 in vitro can regulate the apoptosis and proliferation of VECs, but whether it still has the same effect in DVT animals， and what the mechanisms it working are all in need of further study. On the basis of previous studies, HIF1A-AS1 overexpression/silencing model will be constructed at both animal and cell levels to detect the formation of thrombus, apoptosis and proliferation of VECs, HIF1A-AS1 and related protein levels, to confirm the effects of HIF1A-AS1 regulating VECs apoptosis and proliferation. The protein network interacting with HIF1A-AS1 in VECs will be analyzed to explore the mechanism of HIF1A-AS1 in regulating apoptosis of VECs, and providing basis for the molecular regulation and targeted therapy of DVT.

深静脉血栓（DVT）危害大，发病机制不清，血管内皮细胞（VECs）凋亡在DVT发生中起关键作用。我们前期建立体外VECs凋亡模型，检测发现HIF1A-AS1是变化最为显著的lncRNA，再对HIF1A-AS1进行沉默，发现其沉默后能够抑制VECs凋亡并促进增殖，提示HIF1A-AS1在体外实验中能够调控VECs的凋亡与增殖，但其在DVT动物体内是否仍具有调节VECs凋亡与增殖的作用，及其调控VECs凋亡的具体机制如何，均有待我们进行深入的研究。在前期基础上，本项目拟在动物和细胞层面，均构建HIF1A-AS1过表达/沉默模型，检测成栓情况、VECs的凋亡增殖情况、HIF1A-AS1及相关蛋白水平，明确HIF1A-AS1调节VECs凋亡与增殖作用；并分析VECs中与HIF1A-AS1相互作用的蛋白网络，探索HIF1A-AS1调节VECs凋亡的机制，为DVT的分子调控和靶向治疗提供依据。

深静脉血栓对人类的健康构成严重威胁，其特点是死亡率升高、同时易导致人残疾，生存质量下降。而血管内皮细胞(VECs)位于血管的最内侧，容易受到刺激。血管内皮细胞凋亡与动脉硬化、血栓形成、斑块侵蚀等多种心血管疾病（CVD）密切相关。研究证明非编码RNAs (NcRNAs)可以作为深静脉血栓等CVD的重要调控机制之一。LncRNA缺氧诱导因子1 α -反义RNA 1 (HIF1A- AS1)是HIF1A的三种反义RNA之一， HIF1A-AS1在HUVEC中被一种DNA拓扑异构酶抑制剂吖啶黄酮高度上调，这也可能破坏HUVEC。我们前期研究表明，抑制HIF1A-AS1可促进棕榈酸(PA)处理诱导的HUVECs增殖和减少凋亡，在本研究中，我们主要阐明了HIF1A-AS1在HUVECs中的作用及其潜在机制。本研究结果为今后深静脉血栓等CVD的治疗提供了潜在的研究方向。我们构建HIF1A-AS1全长的腺病毒载体（过表达腺病毒载体）；根据HIF1A-AS1设计短发卡RNA（shRNA）序列并将其克隆至腺病毒载体（沉默载体），将上述构建的过表达/沉默载体转染至HUVECs，再构建PA诱导凋亡的HUVECs损伤模型，检测HIF1A-AS1表达水平差异，确定造模成功。然后通过流式细胞术、CCK8、transwell实验和伤口愈合实验，我们发现该lncRNA促进细胞凋亡，减少增殖、迁移和侵袭。此外，miRNA测序结果显示，HIF1A-AS1可全面介导miRNAs的表达。生物信息学分析表明，多个差异表达miRNAs (DEmiRNAs)靶基因参与细胞代谢和凋亡。随后，应用RNA测序和生物信息学分析鉴定差异表达基因(DEGs)。令我们惊讶的是，相当多的DEGs与DEmiRNAs的靶基因重叠。最后，我们又通过共表达网络揭示了DEmiRNAs表达水平与一些初始DEGs之间的相关性强度。因此，我们认为HIF1A-AS1不仅通过直接调控部分基因的表达，还通过间接影响部分miRNAs来介导mRNA的表达水平，从而调控HUVECs功能，揭示了HIF1A-AS1可能在深静脉血栓的发病和进展中发挥关键作用。本研究也为深静脉血栓等CVD的防治提供了一些新的见解和方向。虽然临床应用还有待进一步探索，但这些结果进一步揭示了HIF1A-AS1影响HUVECs的分子机制，为治疗深静脉血栓等CVD提供了科学实验依据。