星型胶质细胞分泌谷氨酸及其机制研究

神经胶质细胞和神经元一起，是构成神经系统的基本细胞。胶质细胞不仅对神经元起营养和支持作用，而且通过分泌递质主动调节神经信号传递。谷氨酸是最重要的兴奋性神经递质，也是胶质细胞分泌的主要递质之一。关于胶质细胞分泌谷氨酸的机制（是否通过钙离子介导的囊泡）问题有长期争论。2005年我们应用电化学微电极和FM荧光成像发现了海马星形胶质细胞释放谷氨酸的一种新模式：钙离子依赖性囊泡kiss-and-run（J Neurosci，2005；Neuroscientists, 2006），成为该领域研究热点。为研究胶质细胞中谷氨酸囊泡分泌的调控机制，本申请将研究胶质细胞分泌囊泡的分子类型，以及已知两种囊泡（溶酶体和20nm囊泡）被诱导释放的动力学。这项研究的重要生理意义是，胶质细胞如何通过钙离子依赖性谷氨酸囊泡释放来主动调控神经信号传递。

为了深入研究胶质细胞的囊泡融合和递质释放过程，本研究选择了培养的和急性分离的小鼠海马星形胶质细胞作为标本。结合内源囊泡蛋白的免疫组化、单色和双色全反射显微镜以及谷氨酸“sniffer”电流记录等实验技术，得到了下面的结论：.1. 小囊泡和溶酶体共存于培养的和急性分离的星形胶质细胞中。大部分小囊泡同时特异表达synaptobrevin 2 和cellubrevin (它们都是与囊泡联合的膜蛋白(vesicle-associated membranes proteins))。使用荧光蛋白标记的synaptobrevin 2可以追踪小囊泡的融合过程。溶酶体特异表达LAMP1 (lysosome-associated membrane protein 1，一种溶酶体的标记蛋白)。使用荧光蛋白标记的LAMP1可以追踪溶酶体的融合过程。.2. FM 染料是一种理论上可以非选择性地标记所有发生融合-内吞过程的囊泡的染料。但是在星形胶质细胞中FM 只能特异标记溶酶体，不能标记小囊泡。.3. 小囊泡和溶酶体的融合都可以被胞内钙离子升高触发。小囊泡和溶酶体融合发生在星形胶质细胞的不同亚细胞位置。小囊泡融合事件的数量多于溶酶体融合事件，速度快于溶酶体融合事件。.4. 谷氨酸转运体 1 (VGLUT1) 只在小囊泡上表达，在溶酶体上没有表达。使用VGLUT 的特异阻断剂台盼蓝或玫瑰红处理星形胶质细胞可以抑制刺激触发的谷氨酸释放。.5. 使用一种Clostridial toxin (tetanus toxin) 特异切断synaptobrevin 2 和cellubrevin 可以显著性的抑制刺激触发的谷氨酸释放，同时溶酶体的形态和融合却没受到影响。.综合以上结果，本研究发现小囊泡和溶酶体对胶质细胞的钙调控囊泡分泌都有贡献，小囊泡和溶酶体有不同的融合动力学，并且证实了小囊泡是胶质细胞分泌谷氨酸所必需的。这一发现可能会对人们了解胶质细胞–神经元相互作用提供新的视角。.6. 使用sniffer 膜片钳方法对星形胶质细胞ATP 分泌的测定是迄今为止关于星形胶质细胞ATP 分泌途径的最直接的证据。本研究揭示了海马星形胶质细胞主要通过P2X7 受体通道介导的非囊泡型途径以非量子化方式分泌ATP，而Ca2+依赖性的溶酶体胞吐不为ATP 分泌所必需。