Stathmin在阿尔茨海默病发生中的作用研究

微管解聚相关蛋白Stathmin与阿尔茨海默病（AD）中神经元纤维缠结的形成及神经元突触的异常发育密切相关。我们前期的研究表明，在AD大鼠模型中，海马区Stathmin的表达明显异常，但目前其在AD发生发展中的作用机理尚不明确。本课题拟通过观察Stathmin在AD大鼠模型中的表达，评价其与AD发生的相关性；分别构建并包装野生型Stathmin、（Ser16突变）Stathmin及Stathmin基因siRNA的重组慢病毒，在细胞水平上观察其对微管的调控作用；利用重组慢病毒感染AD大鼠模型海马区，在动物体内检测Stathmin和神经纤维缠结的相关蛋白tau表达水平并明确它们的作用关系，通过共聚焦显微镜观察神经突起和微管的变化，探讨Stathmin对AD微管异常的作用机理，为AD生物治疗发掘新靶点奠定基础。

微管解聚蛋白stathmin主要通过调控微管的解聚与聚合过程来影响神经系统的发育，神经细胞微管系统的稳定对于神经细胞的存活、维持神经系统正常功能有重要意义，而微管结构和功能的异常与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的发生发展密切相关，但是目前关于stathmin、微管和AD相互作用关系还没有阐明。为了探讨stathmin对微管异常的作用机理和AD发生发展过程中的调控机理，我们在本课题的实施过程中(1) 完成了大鼠原代海马神经元的分离、培养及鉴定；构建了stathmin基因的慢病毒表达载体；完成了stathmin基因的慢病毒表达载体病毒包装及病毒滴度测定；将已建立并鉴定的慢病毒转导PC12细胞和大鼠原代海马神经元细胞，建立细胞模型，检测stathmin表达水平的改变及封闭stathmin基因后微管的变化情况，结果显示stathmin的表达水平可以调控神经细胞微管的状态；(2) 应用RNA干涉技术探讨stathmin siRNA对Aβ1-42诱发PC12细胞损伤的保护作用；RT-PCR和Western Blotting试验结果表明，与对照细胞比较，转染了针对stathmin基因RNA干涉真核表达载体和慢病毒的细胞中，stathmin的核酸和蛋白表达水平都显著下调，表明构建的重组载体可以驱动靶基因siRNA的表达，并且能够特异性地有效下调stathmin的表达；通过MTT试验检测了经Aβ1-42处理后的细胞生长情况，结果显示stathmin表达下调的细胞与对照组比较呈现出明显的细胞增殖上升趋势。随后，用流式细胞仪进一步证实stathmin表达下调的细胞凋亡率与对照组细胞比较明显减少；(3) 建立了含有stathmin干涉片段的慢病毒感染AD大鼠的动物模型，并且通过RT-PCR、Western Blotting和免疫组织化学试验证实了在动物模型中含有stathmin干涉片段的慢病毒可以下调stathmin的表达水平。上述实验结果为探讨stathmin基因在AD发生发展中的作用奠定了一定的实验室基础，也为将来以stathmin基因为靶点的AD基因治疗和提高患者的生活质量开辟了新的思路。