脊髓性肌萎缩症中SMN蛋白缺失致p53去泛素化后积累的机制研究

Spinal muscular atrophy (SMA) is a neuromuscular disorder caused by survival motor neuron (SMN) protein deficiency，and pathological mechanism is not fully clear. Previous studies have confirmed that the activated tumor suppressor p53 signaling regulated downstream pathways: cell cycle and apoptosis in SMA. Preliminary data showed that the gene expression of p53 remained unchanged in SMN depleted SH-SY5Y and NSC-34, whereas the p53 protein level was significantly increased. In addition, using CHX to inhibit protein synthesis, p53 degradation was suppressed over time, and Co-IP showed that marked reduction of binding ubiquitin to p53. We propose that SMN deficiency leads to the accumulation of p53 by regulating ubiquitination degradation. In this project, western blotting, qPCR, Co-IP and other methods will be employed to analyze the molecular mechanism of deubiquitination of p53 caused by SMN deficiency in SMN depleted cells and severe SMA mouse model. Finally, based on the mechanism of deubiquitination, gene interference, agonist or inhibitor will be used to decrease the accumulation of p53 protein to SMA. This study will provide guidance and new idea for the pathogenesis and treatment of spinal muscular atrophy.

脊髓性肌萎缩症（SMA）是由于运动神经元生存蛋白（SMN）缺失导致的神经肌肉疾病，至今其病理机制尚不清楚。我们前期研究证实，在SMA中肿瘤抑制因子p53信号激活，并调控下游细胞周期和细胞凋亡信号活化。预实验结果发现，在敲减SMN蛋白细胞中，p53mRNA水平未变，但p53蛋白水平显著升高；采用蛋白合成抑制剂（CHX）抑制蛋白合成后，发现p53蛋白降解被抑制，且与p53结合的泛素显著减少。我们提出SMN蛋白缺失导致p53去泛素化后积累。本项目将运用蛋白质印记、荧光定量PCR、免疫共沉淀和质谱分析等多种方法，结合严重型SMA小鼠模型，解析SMN蛋白缺失导致p53积累的分子机制。最后根据泛素化降解调控机制干预p53蛋白的积累，达到治疗SMA的效果，为SMA的病理机制和治疗提供指导和新思路。

脊髓性肌萎缩症（SMA）是由于运动神经元生存蛋白（SMN）缺失导致的神经肌肉疾病，至今其病理机制尚不明确。前期报道指出肿瘤抑制因子p53(tumor suppressor protein, p53)参与SMA各组织病理机制调控，但是SMN 蛋白缺失是如何调控 p53信号激活的机制尚不清楚。本项目利用体内外模型，分别从蛋白合成和降解途径，探究 SMN 蛋白缺失导致 p53 蛋白积累的分子机制。研究发现在人源细胞HEK293和SH-SY5Y中SMN蛋白缺失后p53蛋白积累，与小鼠结果不同的是其重要的调控蛋白MDM2和MDM4的可变剪接未发生变化，表明p53蛋白积累不是通过MDM2和MDM4的可变剪接变化调控的。SMN蛋白敲低后，p53 mRNA水平未变，但p53蛋白水平显著升高；抑制蛋白合成后，发现p53蛋白降解被抑制，且与p53结合的泛素显著减少，表明SMN蛋白缺失导致p53降解被抑制。MDM2作为p53最主要的E3泛素连接酶和下游调控靶点，p53激活后MDM2显著上升，但是其与p53的相互作用显著减弱。进一步探究发现p53翻译后修饰包括磷酸化丝氨酸ser15被激活，乙酰化赖氨酸Lys382显著增强，其中Lys382位点是泛素化作用的重要位点，p53 Lys382被乙酰化后抑制MDM2与p53的结合，进而抑制p53泛素化降解。为了进一步研究在SMA细胞模型中发挥主要作用导致p53泛素化被抑制的赖氨酸位点，通过三个截短的p53表达载体，结果发现NATD结构域是p53蛋白泛素化所必须的，有趣的是，SMA细胞模型中可能存在一种不依赖于碳端赖氨酸位点的泛素化降解途径。为了进一步明确参与p53泛素化的赖氨酸位点，我们将20个赖氨酸位点进行突变，发现除了碳端3个位点（K373, K382和K386）突变后显著抑制p53降解，氮端K24, K101, K132, K291, K292和K305位点突变也抑制p53降解。本项目研究表明SMN缺失后增加了p53的磷酸化Ser15和乙酰化Lys382水平，抑制MDM2与p53的结合，除此以外氮端K24, K101, K132, K291, K292和K305位点也参与p53降解，抑制p53泛素化降解途径，最终导致细胞周期组织和细胞凋亡。为SMA的病理机制和治疗提供指导和新思路。