脊髓性肌萎缩症SMN基因异常剪接的机制研究

Spinal muscular atrophy (SMA) is a common autosomal recessive inherited neurological disease, which is caused by the mutations in survival motor neuron gene 1 (SMN). Interestingly, SMN2 gene, a highly identical homolog of SMN1 with only 5 nucleotide differences between them, encodes only a small part of full-length SMN protein, which cannot compensate for the homozygous loss of SMN1and gives rise to the development of SMA. To date, many studies mainly focused on the mechanisms of abnormal gene splicing of SMN2 gene. Recently, we successfully established non-invasive urine-derived cell lines from SMA patients and health controls for further research of SMN expression and drug screening. Besides, we obtained the induced pluripotent stem cells (iPS) reprogrammed from urine cells from non-identical twins in vitro. In the present study, we intend to perform the gene correction of SMN2 gene to substitute the 5 nucleotide differences by TALEN technology, and further explore the mechanisms of SMN2 gene splicing on induced motor neuron level, from axonal growth, SMN expression to transcriptome analysis, and shed some light on the fundamental mechanism and effective treatment of SMA.

脊髓性肌萎缩症(SMA)是常见的常染色体隐性遗传病之一，其致病基因为运动神经元生存基因（SMN），SMN基因存在两种同源性极高的拷贝SMN1、SMN2，二者仅有5个碱基的细微差异。在SMN1缺失的情况下，SMN2剪接异常导致产生的全长蛋白极少,不能弥补SMN1的功能而发病。目前关于SMA发病机制研究主要集中在SMN异常剪接的机制方面，SMA是剪接体病的典型代表，一直是研究的焦点。我们前期建立了直接源于SMA患者及对照的无创性尿液细胞系，进行了SMN蛋白表达、定位及药物干预等系列研究，并建立了SMA患者及其异卵双生健康同胞的iPS细胞模型。本项目将针对SMN1与SMN2基因的 5个碱基差异点，采用TALEN技术对SMA患者iPS细胞模型进行基因修饰，进一步在运动神经元水平探讨"SMN基因异常剪接"这一核心问题，为阐明本病的发病机制及探索有效的防治手段提供理论依据。

本项目在前期研究基础上，开展了如下系列研究：1、建立了不依赖滋养层体系的人多能干细胞（iPS）重编程体系，这种iPS细胞具有与胚胎干细胞相同的多向分化潜能。2、对上述iPS细胞的SMN2基因进行修复,筛选出了修复的细胞株，从RNA及蛋白水平证实修复后SMN全长转录本及蛋白明显上调。3、通过快速高效的运动神经元分化方案，我们发现SMN1基因的缺失并未改变运动神经元的分化效率及成熟过程。蛋白印迹表明SMN蛋白在运动神经元中表达较运动神经元前体细胞升高，同时SMA患者来源细胞的SMN蛋白较对照也明显降低，且这种差别在运动神经元水平更加明显。我们进一步发现I型和III型SMA患者来源的运动神经元的轴突生长受到了抑制，其中在I型SMA患者来源的运动神经元中，还发现了膜电位的高兴奋性。4、通过慢病毒感染方式，将ASCL1, ISL1, NEUROD1, BRN2, HB9, LHX3, MYT1L和NGN2在成纤维细胞中过表达，实现成纤维细胞直接诱导分化获得运动神经元，体外诱导的神经元可以模拟部分的脊髓性肌萎缩症的表型，SMN蛋白表达降低，神经元突起生长较对照慢，更易发生细胞凋亡，是SMA研究新的细胞模型。5、基于尿液细胞模型，分别应用丙戊酸盐、辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）、反义核酸进行了药物干预实验，提示SAHA可以显著提高SMN蛋白水平，是SMA患者治疗的一个新的选择。6、基于SMA及CAS9转基因小鼠模型，进行了干预研究。与美国冷泉港实验室合作，应用反义核酸ASO10-29对Ⅰ型SMA小鼠进行皮下注射治疗，与阴性治疗组相比，治疗组生存期明显延长。7、对其它神经遗传病如特发性基底节钙化、肝豆状核变性等进行了基因变异分析，发现了若干新的突变位点，发现了特殊表型的病例。上述系列研究结果进一步阐明了SMA的发病机制及药物干预的新靶点，同时也面向临床进行了应用研究，为患者解决了实际问题。本系列研究共发表论文8篇，其中SCI论文7篇。获得福建省科技进步三等奖、中国杰出青年神经内科医师奖、福建省青年科技奖及运盛青年科技奖各一项。