NAMPT调节谷氨酰胺-谷氨酸循环保护脑缺血损伤的研究

Glutamate-glutamine cycle is critical in maintaining neuronal metabolism after cerebral ischemia. High-field nuclear magnetic resonance (NMR) enables tracing the metabolites of the stable isotopically labeled precursor, and permits investigation of glutamate-glutamine cycle in vivo and in vitro. Nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) is a key enzyme for the synthesis of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), and plays an important role in metabolism. Although NAMPT is highly expressed in neurons, the effects of NAMPT on neuronal metabolism remains unknown. Recently, we discovered that NMAPT was able to modulate the glutamate-glutamine cycle by regulating the metabolism in neurons, and played neuroprotective roles against cerebral ischemia. Here we propose to conduct NMR measurements of the metabolites of [1-13C]-glucose and [1,2-13C]-acetate, and monitor their change in glutamate-glutamine cycle after cerebral ischemia. Further, we plan to determine whether and how NAMPT regulates the expression and/or the activity of glutaminase in neurons, and whether such regulation of NAMPT on glutaminase results in the modulation of the glutamate-glutamine cycle. The expected finding will reveal that whether such modulation is related with its protective effect of NAMPT on cerebral ischemia. The proposed study will clarify the multi-cellular mechanisms of the neuroprotective effects of NMAPT, and depict the global changes of glutamate-glutamine cycle after cerebral ischemia.

神经元与星形胶质细胞间的谷氨酰胺-谷氨酸循环对脑缺血后维持神经元代谢极为重要，但研究手段匮乏。近年来结合定点13C标记代谢前体的应用和高场核磁共振谱仪，为该研究提供了高灵敏的检测手段。尼克酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）与细胞代谢密切相关，其在神经元大量表达，但其在神经代谢中的作用不明。近期我们发现，NAMPT可能通过调节神经元的谷氨酰胺酶，影响谷氨酰胺-谷氨酸循环，激活星形胶质细胞，发挥脑缺血保护。为此本项目拟采用[1-13C]葡萄糖、[1,2-13C]醋酸，结合核磁共振技术，示踪小鼠（包括神经元NAMPT基因敲除小鼠）、单独或共培养神经细胞缺血性损伤后，谷氨酰胺-谷氨酸循环的变化；揭示NAMPT如何调节神经元的谷氨酰胺酶，进而影响谷氨酰胺-谷氨酸循环，间接激活星形胶质细胞，保护脑缺血损伤。这可使我们深入了解脑缺血后谷氨酰胺-谷氨酸循环的变化，揭示NAMPT在脑缺血中的作用及机制。

尼克酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）的经典作用是催化合成NAD，促进线粒体依赖的能量代谢。在本人2013-2014的一年期项目中，我们发现，脑缺血后细胞外NAMPT增高，可加重脑内炎症，加重脑缺血损伤，而细胞内的NAMPT发挥神经保护作用。在该项目的基础上，通过本项目的研究，我们发现脑缺血后周边区神经元NAMPT/NAD水平轻度下降，使神经元对星形胶质细胞的代谢依赖增加（包括乳酸和谷氨酰胺），在神经元内，以NAD为底物、PARP1催化的PARylation可以修饰代谢的关键酶，如已糖激酶和乳酸脱氢酶，使神经元对乳酸的利用增加，这种代谢的变化能够被小剂量的NAMPT抑制剂FK866模拟。国际上FK866被研发用于抗肿瘤，而我们发现小剂量的FK866不仅可以调节神经代谢，还可以通过自噬，保护神经元；另外，我们发现NAD前提烟酰胺核糖（NR）对神经元也有保护作用。在脑缺血后，我们发现尼克酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）是小胶质细胞释放的一种新的炎症因子，小胶质细胞通过外泌体（exosome）释放NAMPT，或者直接释放未经包裹的NAMPT蛋白，这两类细胞外NAMPT的作用是否有差异，我们尚在研究中。由于NAMPT抑制和NAMPT敲除小鼠的结局不同，使我们认识到线粒体和非线粒体NAMPT作用的不同，这部分工作已经作为项目的延伸。最后，由于NAMPT/NAD对神经元ATP代谢有较大的影响，由此抑制了蛋白酶体对泛素激酶PINK1的降解，使泛素被磷酸化，从而使泛素系统发生“重构”，最终影响蛋白质的物质代谢，这一部分也成为本项目的延伸。本项目发表了6篇SCI论文，1篇国内论文，另有2篇正在审稿中、多篇论文在撰写中，培养博士后出站1名，出站后被华中农业大学引进，成为独立PI；培养硕士生毕业4名，另有2名即将于2020年5月毕业，其中1名硕士生获国家奖学金。此外，通过本项目的实施，为本实验室NAMPT调节能量和物质在脑内代谢的研究，提供了基础和研究的新方向。