补阳还五汤通过调节星形胶质细胞谷氨酸代谢通路保护脑缺血损伤的机制研究

Astrocytes can decrease the toxicity of glutamate by increasing glutamate metabolism so as to protect cerebral ischemia injury. Glial glutamate transporter-1 (GLT-1) and glutamine synthetase (GS), which are both located in astrocytes, are mainly responsible for transporting and decreasing glutamate respectively. Buyang Huanwu Decoction (BYHWD) which is famous in Traditional Chinese Medicine treating cerebral ischemia, is reported to decrease glutamate concentration. We speculate that BYHWD accelerated glutamate reuptake and metabolism by regulating astrocytic GLT-1 and GS via MAPKs direct pathway and PACAP indirect pathway. In this study, inhibitors of GLT-1 and GS would be used as comparison to investigate the role of BYHWD in regulating astrocytic GLT-1 and GS on the model of middle cerebral artery occlusion (MCAO); also inhibitors of MAPKs and PACAP would be used to further explore the function approaches and molecular mechanism on cultured astrocytes and astrocyte-neuron coculture. Our study would provide direct experimental evidence that astrocytes play an important role in BYHWD anti-cerebral ischemia injury, and offer new vision that astrocytes is an important target for Traditional Chinese Medicine.

星形胶质细胞可通过增加谷氨酸的代谢减轻其毒性保护脑缺血损伤，其中谷氨酸转运体（GLT-1）负责转运，谷氨酰胺合成酶（GS）负责降解。中医治疗脑缺血的传统名方补阳还五汤可降低谷氨酸浓度，推测补阳还五汤可能通过MAPKs直接途径或PACAP间接途径调节星形胶质细胞GLT-1和GS表达促进谷氨酸重吸收与代谢。本项目拟利用GLT-1抑制剂和GS抑制剂干预作对照，在脑缺血动物模型上研究补阳还五汤对星形胶质细胞GLT-1和GS的调节作用；利用MAPKs抑制剂和PACAP抑制剂，在单独或与神经元共培养的星形胶质细胞体外模型上进一步研究补阳还五汤影响星形胶质细胞GLT-1和GS的作用途径和分子机制。本项目为星形胶质细胞参与补阳还五汤保护脑缺血损伤提供直接实验依据，也为星形胶质细胞成为中药的靶点研究开辟新的思路。

脑缺血的高发病率、高死亡率和高致残率，对国民健康造成了很大的威胁。补阳还五汤是中医药领域治疗脑缺血的经典名方，随着对脑缺血损伤研究地不断深入，大量实验证明星形胶质细胞在神经元损伤过程中发挥了重要的作用，但是目前尚不知星形胶质细胞如何参与补阳还五汤对脑缺血的保护作用。在该项目的资助下，一方面通过体内实验探讨了补阳还五汤对脑缺血后星形胶质细胞GLT-1和GS的影响及可能的机制，结果发现：（1）补阳还五汤上调脑缺血后海马CA1区的GLT-1和GS的表达，第3天最为显著。（2）对GLT-1/GS和星形胶质细胞标记物GFAP进行了免疫荧光双染，表明GLT-1/GS主要在星形胶质细胞表达。（3）ELISA实验表明补阳还五汤可上调脑缺血后PACAP-38的表达，进一步应用其抑制剂PACAP-(6-38)可减轻补阳还五汤对星形胶质细胞GLT-1/GS上调的作用，表明补阳还五汤是通过PACAP-38上调星形胶质细胞GLT-1/GS的，同时在一定程度上也证实了补阳还五汤对GLT-1/GS的作用。（4）补阳还五汤抑制星形胶质细胞的激活，PACAP-(6-38)减轻该抑制作用，表明星形胶质细胞参与了补阳还五汤抗脑缺血损伤的作用。另一方面，为了进一步探讨补阳还五汤是否可直接作用于星形胶质细胞，本项目采用体外原代培养星形胶质细胞建立缺氧缺糖的体外缺血模型进行实验。体外实验表明:（5）补阳还五汤含药血清组于复氧复糖24h后GLT-1和GS蛋白表达上调达到最高水平，且与对照血清组比有显著差异。而且谷氨酸检测表明上调的GLT-1/GS降低了24h后细胞培养液中谷氨酸的浓度。（6）缺氧缺糖含药血清组较缺氧缺糖对照血清组p-p38MAPK的表达明显上调，p-ERK、p-JNK的表达均无明显变化。进一步应用SB203580阻断p38MAPK通路活化的抑制剂组与缺氧缺糖含药血清组比较，GLT-1、GS表达明显下调，GFAP表达明显上调。（7）细胞活力检测进一步证实补阳还五汤含药血清对星形胶质细胞发挥保护作用。这些结果表明补阳还五汤通过上调GLT-1和GS表达，增强转运降解谷氨酸、减轻谷氨酸的“毒”性作用发挥保护作用，“扶正去瘀”，为补阳还五汤多靶点、多途径的作用机制提供新的实验依据，为星形胶质细胞参与补阳还五汤保护脑缺血损伤提供直接的实验依据，也为星形胶质细胞成为中药的靶点研究开辟新的思路。