糖胺聚糖的序列及其与肿瘤蛋白的相互作用位点研究

Glycosaminoglycans are complicated and highly negatively charged linear polysaccharides. Biological studies showed that the cell-surface and extracellular-matrix heparan sulfate glycosaminoglycans regulated tumor genesis, progression and metastasis by modifying their structures. However, the lack of powerful carbohydrate analytical chemistry tools limited the understanding of the relationship between fine structure changes of heparan sulfate and the effects on their interaction with tumor factors. In this study, we will establish novel and systematic analytical approaches for heparan sulfate using modern mass spectrometry technologies, including fingerprinting methods for intact heparan sulfate chains as well as their building blocks; sequencing methods for critical heparan sulfate oligosaccharides using tandem mass spectrometry in both the positive and the negative modes; and heparan sulfate-protein interaction motifs elucidating methods using covalently cross-linking and hydrogen/deuterium exchanging followed by mass spectrometry analysis. We will then investigate the heparan sulfate in the mouse lung cancer models in order to examine and improve our approaches. Our aim is to find the significant heparan sulfate modifications and reveal their effects on interaction with tumor factors. This project will provide not only novel approaches for further understanding the role of glycosaminoglycans in tumor, but also structural-function evidences for discovering new tumor biomarkers and drug targets.

糖胺聚糖是一类结构复杂的酸性直链多糖大分子。生物学研究表明细胞表面和细胞间基质内的硫酸乙酰肝素类糖胺聚糖通过自身结构的变化调控肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。然而研究这些糖链的细微结构如何变化以及怎样影响与肿瘤蛋白的相互作用尚缺乏有力的糖分析化学工具。本项目以现代质谱技术为主要手段，建立和创新硫酸乙酰肝素分析的系统方法，包括指纹图谱方法分析组织糖链及其基本组成单元；正、负离子模式下的多级质谱解析关键寡糖的序列；以及共价交联质谱法和氢氘置换质谱法研究硫酸乙酰肝素与靶蛋白的空间相互作用位点。通过对肺癌小鼠模型组织硫酸乙酰肝素糖链变化的研究验证方法体系的有效性并加以完善，发现肿瘤特征糖链并测定其功能域的序列，并研究其如何影响与肿瘤相关靶蛋白的相互作用。本项目的研究结果将为深入理解糖胺聚糖在肿瘤中的作用机制提供方法和手段，为发现新的肿瘤生物标志物和新药靶标提供结构与功能研究基础。

硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，简称HS）是一种直链的酸性多糖大分子，普遍的存在于细胞表面和细胞间基质。HS糖链具有广泛的生物功能，与多种疾病的发生发展密切相关。例如在肿瘤中，HS糖链可以通过自身结构的变化调控肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。然而由于HS糖链的结构复杂性和微不均一性，其分子机制并不明确。本项目首先开发HS糖链的结构研究新工具：我们建立了自下而上的二糖基本单元组成多反应监测液相色谱质谱联用方法，该方法是目前能够最全面鉴定该类分子基本组成单元结构的方法；我们还建立了离线阴离子交换-多级质谱联用方法，能够高效的直接测定复杂混合样品中寡糖的序列。之后，我们开发了研究HS糖链与靶蛋白空间相作用位点的新方法，包括氢氘交换质谱方法和化学交联质谱方法。最后，我们建立了肺癌小鼠模型，从肿瘤组织中分别提取了HS糖链和蛋白质，并进行组学分析。HS糖组分析结果表明，肿瘤组织糖链的硫酸化水平增加。蛋白组分析结果定量比较了246种蛋白，并结合芯片分析结果，从差异蛋白中找到8种HS结合蛋白。综合实验结果和文献结果，建立了肺癌HS结合蛋白差异蛋白库，并从中选取蛋白进行与HS糖链互作的分子机制研究，结果表明不同的HS糖链与其相互作用的模式不同。本项目建立了系统的HS糖链结构表征和分子互作技术体系，为相关糖科学研究提供了重要工具；发现了小鼠肺癌组织与正常组织中HS糖链和蛋白组的差异，为开发新的肺癌检测技术和新药靶点提供了研究基础。