低分子肝素糖链的结构细分及抗动脉粥样硬化机制研究

Low molecular weight hepains (LMWHs) are important carbohydrate based anticoagulant drugs. Besides their anticoagulant function, LMWHs also possess anti-atherosclerosis, anti-tumor, anti-virus and anti-senile dementia activities. LMWHs consist of heterogeneous oligosaccharide chains, and glycan chains are recognized as macromolecules containing bio-information. Each function likely corresponds to a specific sequence. Differentiating functions and structures of LMWHs and understanding their mechanism will help the development of novel heparin-like drugs to treat major human diseases. We propose to separate LMWHs using multiple dimensional chromatographies and evaluate their activity against the endothelial cell apoptosis induced by oxidized low-density lipoprotein; establish new high-throughput sequencing approach to elucidate the specific structure of active components, develop novel cross-link and mass spectrometry method to study the interaction between oligosaccharides and endothelial cell proteome; and verify the anti-atherosclerosis function of LMWH components by animal experiments. This study is expected to reveal the anti-atherosclerosis mechanism of LMWH chains, which is important for developing new carbohydrate based drugs with defined structure.

低分子肝素是一种重要的抗凝血糖类药物。除了抗凝血活性外，低分子肝素还具有抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗病毒和抗老年痴呆等功能。低分子肝素由混合糖链组成，而糖链被认为是包含生物信息的大分子，每一种功能都可能对应着特定的糖链序列。区分低分子肝素各种活性的结构基础并研究其构效机制，有助于开发新型的肝素类糖药物用于多种人类重大疾病的治疗。本项目拟借助先进的多维液相色谱分离技术细分低分子肝素的糖链组分并评价各组分对氧化低密度脂蛋白刺激下内皮细胞凋亡的保护作用；建立新的高通量糖链测序技术测定活性糖链的特征序列；开发新的化学交联质谱技术研究糖链与内皮细胞蛋白组的相互作用；最后用动物实验验证糖链的抗动脉粥样硬化功能。本项目的研究结果将揭示低分子肝素抗动脉粥样硬化的机制，为开发结构明确的新型糖药物提供研究基础。

动脉粥样硬化是一种常见的心血管疾病，可以引发心梗和中风等更为严重的疾病。氧化刺激导致的血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发生的主要原因，但其具体的发生机制仍不明确。在内皮细胞表面分布着一层糖萼，作为血管内壁的最表层与血液直接接触，维持血管与血液间的交换和平衡。硫酸乙酰肝素（简称HS）是糖萼中的主要成分之一，受限于研究工具的缺乏，它们在动脉硬化中的变化和参与机制鲜有报道。于此同时，低分子肝素具有抗动脉粥样硬化活性，但其结构基础和作用机制尚不明确。本项目首先从低分子肝素中分离出不同长度、电荷密度和蛋白亲和活性的糖链组分，评价了各组分对氧化低密度脂蛋白导致的内皮细胞凋亡的抑制作用，然后开发了高通量的计算机辅助质谱测序技术，对相同活性的糖链进行测序并找出其共有序列。利用糖组学技术和蛋白组学技术比较了氧化刺激下内皮细胞糖萼中HS的变化和细胞蛋白组的变化，发现氧化刺激导致糖萼HS的分子量变小、电荷密度变低，由其静电排斥作用支撑的蓬松结构变得致密。而氧化刺激后显著变化的蛋白中相当一部分比例为可以与HS互作的蛋白，其中最关键的蛋白为人胎球蛋白（简称AHSG）。我们通过氢氘交换质谱技术和核磁滴定技术表征了HS与AHSG分子互作的结构基础，发现与肝素抗凝血的结构无关。因此，我们制备了非抗凝肝素，并评价其抗内皮细胞凋亡和抗小鼠动脉粥样硬化活性。结果表明，给药组小鼠的动脉血管内壁斑块显著减少。机制研究发现，AHSG在动脉粥样硬化小鼠血管内壁积聚，而非抗凝肝素可以减轻内皮细胞糖萼HS的损伤，从而维持内皮细胞正常内吞AHSG，减少AHSG的积聚。本项目建立了先进的肝素糖链测序技术和糖链-蛋白互作鉴定技术，为相关糖科学研究提供了重要工具；从糖胺聚糖-蛋白互作组的角度为阐明动脉粥样硬化的机制提供了新的科学数据，为开发新的动脉粥样硬化诊断和治疗手段提供了研究基础。