绵羊piRNA的序列特征及其对季节性繁殖的表观遗传调控作用

Seasonal reproduction is a main bottleneck restricting the efficient production in sheep industry. If the ovine seasonal reproduction would be changed using genetic methods, the annual parities of ewes will increase and the stable production of mutton will be maintained throughout the year. However, the molecular regulatory mechanism of seasonal reproduction is still unclear. PiRNA is a class of small non-coding RNA discovered in recent years. They play the important role in regulation of gene expression. Recently, the presence of piRNAs in ovine ovary was predicted by our team for the first time, and some characteristics of piRNAs and piRNA clusters were preliminarily analyzed. However, the regulation of piRNAs on the expression of seasonal reproduction related genes are not clear till now. Therefore in this study, firstly, the sequence characteristics of ovine piRNAs/pilRNAs will be further analyzed using the small RNA sequencing technology. Secondly, the tissue specificity and reproductive periods specificity of piRNAs expression will be analyzed. Thirdly, the epigenetic regulatory role of piRNAs in expression of seasonal reproduction related genes will be elucidated: the components of PIWI-piRNA complex will be identified; the DNA methylation and heterochromatin of target genes will be detected after over-expression of piRNAs in vitro. The results of this study will help to reveal the epigenetic regulation mechanism of ovine seasonal reproduction and provide the theoretical basis for the genetic operation to regulate ovine seasonal reproduction.

季节性繁殖是限制绵羊高产的主要瓶颈，若能从遗传上改变绵羊季节性繁殖的特性，则可增加母羊年产胎次，维持羔羊肉的全年稳定生产，然而季节性繁殖的遗传调控机制尚未明确。piRNA是近年来发现的一种非编码小RNA，在基因表达调控方面发挥着重要的作用。前期我们团队首次在绵羊卵巢中发现了piRNA的存在，并分析了piRNA及piRNA簇的部分特征，但是piRNA对绵羊季节性繁殖相关基因的调控机制尚不明晰。因此本项目拟利用小RNA测序技术进一步分析绵羊piRNA/pilRNA的序列特征，揭示绵羊piRNA组织特异性和繁殖时期特异性表达规律，探索 piRNA在季节性繁殖相关基因表达中的表观调控作用：鉴定piRNA-PIWI沉默复合体成分，分析过表达piRNA之后靶基因DNA甲基化和异染色质形成情况。该研究结果将有助于揭示绵羊季节性繁殖的表观遗传调控机制，为遗传操作调控绵羊季节性繁殖奠定理论基础。

季节性繁殖是限制绵羊高产的主要瓶颈，然而季节性繁殖的遗传调控机制尚未明确。前期我们团队首次在绵羊卵巢中发现了piRNA的存在，并分析了piRNA及piRNA簇的部分特征。在此基础上，本项目揭示了绵羊PIWI蛋白在绵羊多个组织中的表达情况及在性腺中的细胞定位，利用小RNA测序技术分析了绵羊睾丸和卵巢中piRNA/pilRNA的序列特征，阐明不同繁殖季节绵羊卵巢组织中piRNAs表达差异，挖掘出若干可能与发情季节性相关的piRNAs序列，探索piRNA在季节性繁殖相关基因表达中的表观调控作用。另外，分析了高低繁殖力品种公羊睾丸之间piRNAs表达差异，++型和BB型小尾寒羊卵巢组织之间piRNA表达差异及小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织之间piRNA表达差异。结果显示PIWI proteins呈现多组织表达特征，但是主要集中在性腺表达。在公羊睾丸中，它们主要定位在初级精母细胞中，暗示它们主要在精子发生早期起作用。在母羊卵巢中，它们主要分布在窦状卵泡的卵母细胞和卵巢血液中的白细胞中。我们的结果有助于进一步了解PIWI蛋白在绵羊精子发生、卵子发生和免疫防御过程中的功能。来源于卵巢的piRNAs reads 主要分布于24～33nt，piRNAs tags无明显的5’碱基偏好性和乒乓特征。piRNAs主要比对到基因组的内含子区域，休情期比对到重复序列的piRNAs比繁殖季节高。重复序列来源的piRNAs主要比对到反转录转座子区域。piRNAs主要分布在1～4、7、11、15及X染色体上。休情季节和繁殖季节差异piRNAs靶基因主要富集在Thyroid hormone signaling pathway、Cytokine-cytokine receptor interaction等通路。针对绵羊睾丸，单羔组的piRNAs tags呈现单峰（25-27nt）而多羔组呈现双峰（25-27nt及28-30nt）分布。piRNA簇均具有明显的链特异性、首位U偏好性和乒乓循环特征。piRNAs均主要比对到重复序列区域，主要分布在3、7、15、18、20号染色体上。单多羔组之间差异piRNAs的靶基因显著富集在PIK3-Akt signaling pathway、steroid biosynthesis等通路。该研究结果有助于深入了解动物繁殖分子机制，在提高羊繁殖力方面具有一定应用潜力。