蒽醌骈合型烯二炔天然产物的生物合成途径研究

The enediyne antitumor antibiotics are a family of natural products with unprecedented structures and exquisite biological activities, and their use as anticancer drugs has been demonstrated clinically. According to the size of the enediyne core, the enediynes are classified into the 9-membered or 10-membered subcategories. The 10-membered enediynes can be further divided into two families, the calicheamicin-like enediynes and the anthraquinone-fused enediynes. Comparing to the well-studied biosynthetic pathways for the C-1027 exemplified 9-membered enediynes and calicheamicin-like enediynes, the biosynthetic pathways for anthraquinone-fused enediynes remain elusive. Streptomyces sp. CB03234, producer of our recently discovered anthraquinone-fused enediyne, Tiancimycin A (TNM A), provides a valuable platform to study the biosynthetic pathway for anthraquinone-fused enediynes, due to its genetic amenability and high TNM A production. Five biosynthetic intermediates were isolated from CB03234 wild-type and mutant strains in our preliminary study, which enable us to propose a biosynthetic pathway for TNM A. In this project we plan to study the proposal by combining the comparative studies of the four gene clusters for anthraquinone-fused enediynes, gene inactivation, fermentation, product isolation and structural elucidation, and in vitro enzymatic reaction. We also plan to utilize the CB03234 wild-type and mutant strains as hosts for heterologous expression of genes from other anthraquinone-fused enediyne gene clusters, to study their biosynthetic pathways and to produce novel and unnatural anthraquinone-fused enediynes by combinatorial biosynthesis.

烯二炔类天然产物是一类具有独特化学结构和优异生物活性的化合物，通常分为九元环类和十元环类，而十元环烯二炔又可分为卡力奇霉素类和蒽醌骈合型。对以C-1027为代表的九元环烯二炔和对卡力奇霉素类十元环烯二炔的生物合成研究极大地促进了对烯二炔生物合成机制的理解，但由于研究平台的缺乏，对蒽醌骈合型烯二炔的生物合成途径知之甚少。我们最近发现的天赐米星A是第三个蒽醌骈合型烯二炔天然产物，它的生产菌链霉菌CB03234具有良好的遗传可操作性和较高的产量，可作为研究蒽醌骈合型烯二炔生物合成途径的良好平台。本项目拟在前期工作的基础上，从四种基因簇的比较研究着手，结合基因缺失、化合物分离鉴定及体外酶促反应等手段，研究天赐米星A的生物合成途径，并计划以CB03234为宿主研究其它蒽醌骈合型烯二炔天然产物的生物合成和通过组合生物合成产生新的非天然蒽醌骈合型烯二炔天然产物。

蒽醌骈合型烯二炔天然产物是放线菌生产的一类含有蒽醌结构的十元环烯二炔，是作为抗体偶联药物的弹头分子的候选药物，对多种肿瘤细胞系的IC50值在皮摩尔至纳摩尔水平，目前一些国际领先的公司和研究团队在进行基于它们的抗体偶联药物开发。对于蒽醌骈合型烯二炔天然产物的生物合成途径研究是当前的一个热点，近年来取得了一系列重要突破。由于这类化合物具有极强的细胞毒性，它们在野生型宿主中的产量极低，限制了对它们的生物合成研究和临床开发。在本项目中，我们系统利用基因组测序、比较转录组分析、核糖体工程、基因组重排、基因调控网络解析、代谢工程改造、发酵条件优化、异源基因表达、化学半合成修饰等策略，对CB03234和M. yangpuensis等蒽醌骈合型烯二炔天然产物的生产菌株进行了改造，极大地提升了TNM A和D以及YPM A等重要AFE类化合物的产量。经过改造的CB03234突变株，在30升发酵罐中TNMA/D的产量达到了43.5 mg/L，比野生型CB03234的产量提高了145倍，是迄今为止报道的烯二炔天然产物的最高产量。通过我们建立的便捷的AFE类化合物的分离纯化流程和特异吸附材料，可以实现蒽醌骈合型烯二炔天然产物的快速、高效分离纯化。根据测算，这类化合物的产量达到100 mg/L以上时，可以达到工业化生产水平，目前我们正在基于前期积累的知识对CB03234中TNM类化合物的产量进行进一步的优化，图谱后续的抗体偶联药物开发的原料供应瓶颈。在生物合成途径研究中，我们对AFE类化合物的生物合成路径也有了较为系统的研究，发现了TNM H和W、YPM F和G等十余种具有新官能团的新型蒽醌骈合型烯二炔天然产物，促进了AFE类化合物的生物合成途径研究，为烯二炔化合物与连接物的连接创造了更多的条件。本研究中使用的多种策略，也为其它链霉菌中重要天然产物的产量提升提供了系统的参考和借鉴。