大片形吸虫分泌排泄产物与水牛树突状细胞/调节性T细胞互作过程中的甲基化和羟甲基化调控机制的研究

Dendritic cell (DC) and regulatory T cell (Treg) play a strong regulatory function. Our study confirmed that Fasciola gigantica excretory-secretory products (FgESP) can regulate DC function, and play an important role in the parasite and host immune interaction, but to data, there is no study about this regulatory mechanism. Considering the DC mature and the T cell differentiation is inseparable with methylation and hydroxymethylation, a scientific hypothesis was raised that the methylation and hydroxymethylation play a important role in mediate the FgESP induction of the buffalo DC/Treg immune regulatory network. To prove this hypothesis, adopted RRMHS sequencing method to detect the DNA methylation and hydroxymethylation in FgESP interaction with DC. Employing flow cytometry, gene silence and overexpression technology to study the function of MBD2/TET1 in Treg which mediated by FgESP and DC, clarifying methylation and hydroxymethylation in FgESP and DC/Treg cross immunoregulatory mechanisms. On this Based, uncovering the immunomodulatory molecules of FgESP and verifying their function in the DC/Treg cell methylation and hydroxymethylation. Clarification of the DC/Treg regulatory mechanisms and determine the FgESP regulatory molecules is great significance for guiding Fasciola vaccine and new drug development.

DC和Treg细胞有强大调节功能，我们的研究证实FgESP能调节DC的功能，在虫体和宿主相互免疫作用中起重要作用，但目前缺乏对该调节机制的研究。因DC的成熟及T细胞分化与DNA甲基化和羟甲基化过程密不可分，故本项目提出DNA甲基化和羟甲基化在FgESP诱导水牛DC/Treg交叉调控网络中发挥重要调节作用的科学假说。为证明该假说，采用RRMHS测序等方法探明甲基化和羟甲基化在FgESP与DC互作中的作用；重点通过流式细胞术、基因沉默和过表达技术研究MBD2/TET1在FgESP与DC介导的Treg相互作用过程中的作用，阐明甲基化和羟甲基化在FgESP与DC/Treg互作过程中的免疫调节机制；在此基础上，发掘FgESP中与免疫调节相关的分子，并验证其在DC/Treg甲基化和羟甲基化中的作用。阐明DC/Treg调控机制和鉴定FgESP中的调控蛋白对指导片形吸虫疫苗研发和新药物开发具有重大意义。

研究背景：蠕虫在宿主体内迁移和发育过程中会通过持续释放分泌排泄产物来影响宿主的免疫微环境，诱导宿主产生调节性DC和Treg细胞。本论文着重探讨FgESP诱导水牛DC/Treg的甲基化/羟甲基化调节机制。.研究内容：（1）建立和优化水牛外周血源DC的体外诱导和培养方法。（2）FgESP对水牛DC成熟及组蛋白甲基化的影响。（3）获得FgESP对水牛DC全基因组DNA甲基化/羟甲基化水平的影响。（4）分析FgESP对水牛DC的调节作用与DNMT1/TET1蛋白的关系。（5）FgESP诱导水牛树突状细胞对T细胞分化作用的研究。.研究结果：（1）成功分离培养并鉴定了水牛外周血单个核细胞源DC。（2）FgESP能够抑制DC成熟，降低组蛋白H3K4甲基化水平，升高组蛋白H3K9甲基化水平。（3）FgESP作用后水牛DC有5432个基因的5-甲基胞嘧啶（5-mC）水平和360个基因的5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）水平发生显著变化，其中有111个基因同时发生了5-mC和5-hmC水平改变，GO和KEGG分析表明这些基因高度富集于免疫应答相关通路中，部分涉及癌症相关通路。（4）qRT-PCR验证高甲基化基因TLR2、TLR4和IL-12B的mRNA水平显著下调或呈下降趋势，高羟甲基化基因TNF-α的mRNA水平显著上调，提示FgESP对水牛DC成熟的抑制作用与DNA甲基化/羟甲基化存在直接联系。（5）未发现到FgESP混合蛋白中能够与水牛DC的DNMT1/TET1结合的特异性蛋白组分，而细胞免疫荧光法观察到Cy3荧光标记的FgESP分布于DC细胞质中，因此与软件预测定位于细胞核的DNMT1和TET1蛋白不存在直接结合。（6）DNMT1和TET1相关通路分别参与FgESP对DC分泌IL-6和IL-12能力的调控，提示FgESP对水牛DC成熟和功能的调控与DNMT1/TET1存在关联。