利用条件性基因敲除小鼠研究NOD2在肝癌发生中的作用和机制

Hepatic pattern recognition receptors-induced inflammaion responce, which is triggered by bacterial products, participates in the carcinogenesis of hepatocellular carcinoma (HCC). NOD2 receptor, a new pattern recognition receptors, primarily recogonizes bacterial peptidoglycan degradation products muramyl dipeptide (MDP), and mediates immune/inflammatory response. Previous studies show that NOD2 receptor is functionally expressed on hepatocytes. We reported that elevated bacterial products MDP in blood stream can activate NOD2 receptor, leading to high inflammation state. Our previous studies also indicate that NOD2 receptor may participate in the carcinogenesis of HCC: 1. NOD2 receptor is overexpressed in clinical HCC tissues and HCC cell lines; 2. NOD2 agonist can activate MAPK and NFkb signalling pathway, and promote HCC cells proliferation and metastasis; 3. Hepatic NOD2 receptor is raised in a chemical-induced HCC mice model. In the present study, we aim to construct DEN-induced HCC model with NOD2 gene knockout mice (systemic knockout and conditional hepatic knockout), and study the role of NOD2 in different stages of HCC carcinogenesis.Our study will provide new clues to understand the role of pattern recognition receptor in HCC carcinogenesis.

肠源性细菌产物激活肝脏模式识别受体促发的炎症反应，是影响肝癌发生、发展的重要因素。肝脏新模式识别受体NOD2，参与对肠源性细菌产物的免疫识别和炎症反应，但其在肝癌发生、发展中的作用尚不明晰。我们前期研究发现肝脏表达的NOD2可能参与肝癌发生过程：肝癌组织和肝癌细胞系NOD2表达上调，NOD2高表达与预后不良有关；活化的NOD2激活MAPK和NFκB信号途径，促进肝癌细胞增殖、转移和炎性因子分泌；化学诱导C57小鼠发生肝癌导致肝脏NOD2表达显著升高。我们拟利用本组已有的NOD2基因敲除小鼠（全身性敲除和肝脏条件性敲除两种），构建化学诱导肝癌动物模型，在化学致癌不同阶段，全面观察和深入探讨NOD2信号在肝癌发生、发展中的作用及机制。并在体外细胞水平研究NOD2信号对肝癌细胞的生物学特性的影响，在临床上评估NOD2信号的预后价值，为研究肝脏模式识别受体在肝癌发生中的作用提供新线索。

肝脏疾病过程中，肠道菌群失调和肠道渗透性增加，肠源性细菌成分通过门静脉系统到达肝脏增多而清除减少，逐渐累积的细菌成分可持续激活肝脏免疫反应，加重肝脏炎症反应和DNA损伤，促进肝脏疾病发展和肝癌形成。但是肝脏中介导细菌成分促癌作用的分子传感器尚不明晰。机体天然免疫系统主要通过多种模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）识别PAMPs以启动宿主免疫应答反应。肝脏NOD2受体通过识别革兰氏阳性菌和阴性菌肽聚糖的降解产物胞壁酰二肽（Muramyl dipeptide, MDP）而被激活，并与受体相互作用蛋白（RIP2）结合启动宿主免疫应答和炎症反应，是比TLR更能广泛感受入侵细菌的模式识别受体。本课题，我们研究了NOD2作为分子传感器介导肠源性细菌成分的促肝癌作用，该传感器将肠道细菌的信号转导为肝癌发生的促癌信号。我们通过qPCR（80对），western blot（30对）和免疫染色（141对）检测临床HCC样品中NOD2的表达。在肝细胞特异性Nod2敲除（Nod2△hep），Rip2敲除（Rip2△hep）和Nod2 / Lmna双敲除（Nod2，Lmna DKO）的条件性基因敲除小鼠中，研究二乙基亚硝酰胺（DEN）/ CCl4诱导的HCC发展过程。结果发现，HCC患者中NOD2的表达上调并被激活，NOD2的高表达与HCC患者的预后不良有关。基因敲除动物研究表明，肝脏特异性敲除NOD2可通过减少炎症，抑制DNA损伤和基因组不稳定性，延缓DEN / CCl4诱导的HCC发生发展。机制研究发现，NOD2通过RIP2依赖性作用，激活MAPK /NF-κB/ STAT3途径来增加肝脏炎症。此外，我们还发现了一种未曾被报道过的新分子机制：NOD2不依赖于RIP2，诱导了核自噬途径。通过这种方式，NOD2发生核转位，直接结合了维持基因稳定性的重要核蛋白“核层粘蛋白A / C”——lamin A/C，并促进其通过核自噬方式降解，从而导致DNA损伤修复受损和基因组不稳定。我们的研究结果发现了促进肝癌的细菌传感器分子NOD2的作用：NOD2将细菌侵袭和核自噬行为联系起来，是肠道来源的微生物代谢产物攻击肝脏细胞的效应器，以其为靶点的肝癌治疗具有潜在的临床应用价值。