酸性条件下新布尼亚病毒SFTSV的结构分析

Severe fever with thrombocytopenia syndrome (SFTS) is an emerging haemorrhagic fever in China, and SFTSV is the causative pathogen. SFTSV, as a newly identified member in the family Bunyaviridae, is the prototype of the third group in the Phlebovirus genus. Surface glycoprotein Gn plays a role in receptor binding, while glycoprotein Gc is involved in membrane fusion. Cyro-electron microscopic (cryo-EM) approaches have been used in studies of various viruses, however, no cryo-EM data are available for SFTSV so far. The acidic conditions induce membrane fusion of SFTSV virions and host endosomes, and therefore the cryo-EM structure at the nanometer level solved under these conditions will help us to understand the conformational changes of the Gn and Gc proteins. Meanwhile, we will test the conditions to express the ectodomains of Gn and Gc in bac-to-bac system. Purified Gn-Gc complexes will be studied via the cryo-EM techniques as well as protein crystallography to produce structural information at atomic level. Combination of architectural knowledge at both lower and higher resolutions would shed light on the structural features on SFTSV surface, and provide novel information to help us to develop effective antiviral therapies targeting SFTSV entry.

发热伴血小板减少综合征是在中国境内新近出现的一种出血热症状，其病原体是SFTSV。SFTSV属于布尼亚病毒科白蛉病毒属，是这个病毒属中第三组的原型病毒株。SFTSV病毒粒子表面分布有糖蛋白Gn和Gc，分别参与受体识别和介导病毒与宿主细胞融合。冷冻电子显微镜(cryo-EM)技术已经用于研究多种病毒的结构，但到目前为止，还没有研究报道SFTSV的cryo-EM结构。酸性条件可以诱导布尼亚病毒粒子与宿主胞内体进行膜融合，因此得到酸性条件下纳米级cryo-EM重建将帮助我们理解Gn和Gc在膜融合过程中的构象变化。同时，我们将探索在昆虫细胞/杆状病毒系统中表达Gn和Gc胞外区域的条件，并通过cryo-EM和蛋白质晶体学技术，来获取原子级分辨率的结构。综合分析低分辨率和高分辨率下的结构数据，将为我们提供SFTSV粒子表面的结构信息，并为针对SFTSV入侵细胞的过程开发有效的抗病毒疗法提供新信息。

布尼亚病毒是一类重要的囊膜病毒，包括多种与人类疾病相关的病原体。在病毒的复制周期中，病毒通过内吞作用进入细胞，在酸性的胞内体中，病毒表面囊膜蛋白介导病毒膜与内体膜融合，从而释放病毒基因组到细胞质中。本项目通过对布尼亚病毒囊膜糖蛋白的体外表达和结构研究，试图解释酸性条件下病毒表面囊膜蛋白的结构特征，并为新抗体的制备提供高效稳定的抗原蛋白。我们以发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）和新疆出血热病毒（CCHFV）的囊膜蛋白Gn和Gc为目的蛋白，通过杆状病毒表达系统，获取了多种Gn或Gc蛋白截短体，并以不同的拼接方式获得了高表达的Gn与Gc串联体蛋白。SFTSV的Gn-Gc串联蛋白在不同pH条件下表现为不同的聚集状态，说明酸性条件可能驱动SFTSV表面膜蛋白的变构，并由此引发膜融合过程。在对CCHFV的Gc胞外区进行42种截短体表达的基础上，我们发现截短蛋白Gc389在常用的Tris（pH8.0）和PBS（pH7.3）缓冲液条件下表现出不同的聚集特征，提示病毒表面囊膜蛋白可能对外界环境敏感，而这些外界环境条件的改变又进而影响病毒表面的结构均一性。进一步的截短体Gc357在酸性缓冲系统中呈现高度的稳定性，有可能以融合后的稳定构型存在。由于布尼亚病毒结构的稳定性较差，直接进行冷冻电镜研究较为困难，我们讨论了可以通过特异性抗体与完整病毒（或病毒膜蛋白）的相互作用来稳定结构，从而来对布尼亚病毒进行高分辨率结构研究。我们正在以布尼亚病毒囊膜蛋白截短体为抗原制备多种鼠源单克隆抗体，一方面研究抗体在抑制布尼亚病毒感染过程中的作用，同时也期望能找到解决布尼亚病毒结构研究难题的突破口。通过本项目，我们初步研究了布尼亚病毒SFTSV和CCHFV表面膜蛋白在不同酸碱条件下的动态结构特征，为开发针对病毒的抗体提供了有效而稳定的抗原，也为从全病毒水平研究布尼亚病毒结构奠定了基础。