杆状病毒衣壳蛋白自组装纳米管的形成机制

Helical symmetry is widely present in viral capsids, and most structural information of helical capsids are derived only from some RNA viruses. Here, we propose to study the formation mechanism of baculovirus nucleocapsid to illustrate helical assembly principles of DNA viruses. As suggested by previous electron microscopic studies, the whole baculovirus nucleocapsid is not a desirable studying object, largely due to its complicated composition. For simplicity, we will perform assembly studies of VP39, a major component in the capsid sheath. Our previous unpublished data showed that in the absence of any other nucleocapsid-related proteins, VP39 alone assembled into nanotubes in vitro. In order to explain the exact role of VP39 in forming the 'rod-shaped' nucleocapsid, we will study the VP39 nanotubes via cryo-electron microscopy (cryo-EM). Meanwhile, we will perform crystallographic studies of VP39 and its truncates, and also conduct mutagenesis studies of essential residues for assembly. Combination of structural and biochemical information would shed light on designing new nanotubes assembled from modified nucleocapsid proteins. Our research results would serve as a platform for dissecting the complex interaction network of VP39 and other viral components in the native nucleocapsid, and also provide structural support to develop the technology of baculovirus-based gene targeting.

病毒衣壳蛋白常以螺旋对称方式排列，而大多数关于螺旋衣壳的结构信息仅来源于某些RNA病毒。本项目将以杆状病毒的衣壳组装为主要研究内容，探讨螺旋衣壳在DNA病毒中的组装机理。由于完整的杆状病毒核衣壳具有高度复杂的组成，我们将采取化繁为简的策略，以衣壳蛋白VP39的组装体为切入点进行研究。我们的前期结果表明，VP39在其他核衣壳蛋白不存在时，可在体外组装成纳米管状结构。我们拟通过冷冻电子显微镜技术，研究这种VP39纳米管的结构，解释杆状病毒核衣壳成“杆”的分子机制。同时，我们还会对VP39以及其截短体进行晶体学研究，并针对结构组装进行关键位点的突变实验，通过整合结构和生化信息，为设计可修饰的纳米管提供思路。本研究的结果，可以作为我们深入解析VP39与其他核衣壳组分相互作用的研究平台，并为开发以杆状病毒为载体的基因靶向技术提供结构支持。

杆状病毒是一大类特异性感染节肢动物的病毒，长期以来一直是各种应用的研究对象。它们已成功开发为对环境无害的生物杀虫剂，应用于对抗许多农业害虫；而且还作为真核系统表达载体，在昆虫细胞中表达外源蛋白。在结构上，已知杆状病毒基因组DNA包装于短杆状的病毒衣壳内，然而关于它们组装过程的分子机制还知之甚少。为了更好的理解杆状病毒的组装机制，进而将其应用于生物材料领域，本研究利用三种不同的蛋白标签，通过大肠杆菌表达系统对三株杆状病毒的主要衣壳蛋白CP全长基因进行可溶性表达。重组表达的棉铃虫核多角体病毒CP（HearNPV-CP, HaCP）能以可控的方式组装为柔性的生物纳米管。利用冷冻电镜技术对自组装纳米管进行结构分析。HaCP纳米管有两种组装形式：一种管径较细，命名为N-tubes；另一种管径较粗，命名为W-tubes。N-tubes为左手螺旋结构，沿螺旋线排列方向每三圈由34个HaCP蛋白分子组成为一个对称重复单位。而对于W-tubes，由于在横向亚基间较强的相互作用导致其是由12个HaCP蛋白分子组成的圆环结构堆叠而成的长管状结构。通过对HaCP两种组装体的结构比较，我们推测组装亚基间可调的相互作用网络是造成HaCP纳米管柔性的主要原因。在结构研究的基础上，本研究进一步探索了仅由蛋白质构成的HaCP组装体作为纳米支架的应用潜力。通过融合表达的形式将目的蛋白插入GST标签和HaCP之间，可以将功能分子展示于HaCP纳米管外表面上。利用荧光蛋白和荧光素酶作为测试对象，HaCP纳米管可以在体外生理条件下可控地引入多种具有活性的功能分子。柔性的HaCP纳米管相较于刚性的TMV病毒模板而言，不仅能容纳对其组装亚基较大的共价修饰，而且组装过程不需要核酸的参与，这些独特的性质使HaCP纳米管很有希望成为装载功能分子的候选者。