缓释细胞因子的复合材料仿生胆管的构建研究

胆管损伤后的修复与重建是胆道外科一道难题。人们一直在追求一种理想的胆管替代物，近年来，组织工程器官的研究蓬勃发展，但仿生胆管的研究明显滞后。基于我们在医学领域和材料学领域的前期研究，根据胆管组织解剖特点，研制可以缓释诱导分化因子的PLGA/明胶基胆管支架，使其可缓慢释放不同的细胞诱导分化因子，并研究其物理性能、缓释性能、降解性能及生物相容性；体外培养骨髓间充质干细胞并向胆管上皮细胞诱导分化，研究其分化机制及条件；优化胆管支架的结构、性能和骨髓间充质干细胞向胆管上皮细胞的分化条件；将骨髓间充质干细胞种植于构建的新型仿生胆管支架进行培养，体外构建仿生胆管模型并研究细胞与材料、细胞与诱导因子的相互作用机制；体内构建猪组织工程胆管，初步建立仿生胆管的动物模型。若本项目得到资助，将会在仿生胆管的构建、干细胞向胆管上皮细胞分化条件和机制的研究中取得显著成果，也期望为胆道修复重建带来最理想的材料和方式。

医源性胆管损伤的发病率居高不下，各种修复方式都存在着各自的弊端，越来越多的目光投向于组织工程胆管的研究。本实验将大鼠的骨髓间充质干细胞（BMSC）体外诱导分化为胆管上皮样细胞，种植细胞于可以缓释生长因子的生物可降解支架，使其在管状支架内部存活、增殖并进一步成熟，为后期组织工程胆管的研究做理论基础。随后利用猪的同种异体BMSC培养在生物可降解支架内部，评估利用其进行肝外胆管重建的效果。利用贴壁培养法分离大鼠BMSCs，将分离所得的BMSCs贯续暴露于丁酸钠及与肝脏胚胎发生过程相关的细胞因子，使得BMSCs先后分化为肝前体细胞及胆管上皮样细胞。检测细胞表面抗原的表达、相关基因的表达。同时制备可以缓释细胞因子的PLLC/PLGA管状支架，将胆管上皮样细胞与基质胶混匀，涂层在管状支架内部，进行动态培养。检测细胞的存活比例、细胞增殖抗原Ki67及胆管特异性抗原的表达。体内实验方面，获得成年公猪的BMSC，体外培养3周后与含生长因子的基质胶混悬并喷涂至支架内表面，动态培养。建立胆道缺损的动物模型，将同种异体的猪BMSC种植到支架表面，将支架间置于缺损两端吻合。分别在观察的1，3，4月对实验猪进行体重测量、胆道造影、肝功能测定及组织学染色，检测标本组织的SRY基因，以区分再生组织来源。诱导后的细胞可以在体外稳定增殖，并保持向肝、胆系子代细胞继续分化成熟的功能。分别在形态学、蛋白和基因水平鉴定了分化所得的肝前体细胞和胆管上皮样细胞。检测发现胆管上皮样细胞同时表达肝细胞及胆管上皮细胞表面抗原。将其种植于PLLC/PLGA支架并进行动态培养，发现活细胞的比例维持在85%以上，并使胆管上皮样细胞得到进一步成熟。体内实验方面，实验组所有移植动物均在观察期间保持存活并逐渐增长了体重，未表现出黄疸，在吻合区域，术中胆道造影未观察到明显的狭窄、结石、或胆道扩张。组织学检测观察到在移植后的1月和3月时，有不完全的胆管上皮再生，4个月时，修补区域的组织学形态接近正常胆道。SRY基因检测量值表明，分化在移植后胆道再生起主要作用。体外实验通过诱导方案使BMSCs体外分化为胆管上皮样细胞。细胞表达胆管上皮细胞特异性抗原，并能在胆管支架上存活、增殖并进一步成熟，保证了组织工程胆管构建的理论基础。体内实验表明此胆道替代物在观察期能够达到完全的胆管再生，具有治疗许多肝胆疾病的潜力。