基于DNA纳米结构膜组装的肿瘤特异性外泌体电化学检测方法研究

Recently, the incidence and mortality of malignant tumors in China are increasing. Liquid biopsy plays an important role in the early diagnosis which is the key to reduce mortality. The detection of the tumor-specific exosome has the potential to replace tissue biopsy. However, since the existing detection methods of biomarkers on the exosome surface (such as western blot and ELISA) have low sensitivity, it usually requires collecting abundant samples through super centrifuge, making the assay cumbersome to meet the needs of early diagnosis. Electrochemical methods have the advantages of high sensitivity, specificity, convenience and speed, and low cost etc., which have broad application prospects in biological analysis. On the other hand, DNA nanostructures have been demonstrated to be capable of ultrasensitive detection of biomolecules by assembling onto various types of two-dimensional interfaces. By using antibodies or aptamers as the recognition elements, this project develops novel electrochemical methods with ultra-highly clinical sensitivity and selectivity for detecting tumor-specific exosomes via exploring the assembly of DNA nanostructures on the exosome membranes, providing technical support for early diagnosis of tumors.

近年来，我国恶性肿瘤的发病率和死亡率呈现上升趋势，早期诊断是降低死亡率的关键。液态活检在早期诊断中发挥重要作用，其中外泌体检测表现出巨大潜能，对外泌体表面标志物的检测可在一定程度上替代肿瘤的组织活检。然而，现有的外泌体表面标志物检测方法（如western blot、ELISA）由于灵敏度不够，需要借助高速离心机收集大量的样本，抗干扰能力差、耗时耗力，难以满足早期诊断的需要。电化学检测方法具有灵敏度高、特异性强、便捷快速等优势，在生物分析中具有广阔的应用前景。另一方面，DNA纳米结构已被证明可以通过多种作用力组装到各类二维界面上实现生物分子的超灵敏检测。在此背景下，本项目拟以电化学技术为检测手段，以抗体或核酸适体为识别分子，通过探究DNA纳米结构在外泌体膜上的组装以实现电信号的转导与放大，发展能够满足血清学诊断需求的高灵敏度的肿瘤特异性外泌体检测新方法，以期为肿瘤早期诊断提供可能的帮助。

恶性肿瘤是严重危害人类生命健康、制约社会经济发展的重大疾病，目前我国肿瘤发病率、死亡率仍然居高不下，早筛早诊是提高癌症5年生存率的关键。外泌体作为肿瘤诊断和预后的生物标记物已经显现出巨大潜力，但其提取过程繁琐、所需设备昂贵、样品质量不均一等因素严重限制了外泌体的临床转化。本项目围绕外泌体的高效率捕捉与适合外泌体分析的电化学平台的搭建开展了一系列相关的研究工作，构建了针对乳腺癌外泌体分析的电化学检测方案，用于精准分析临床样本中的外泌体，为乳腺癌的早期诊断和肿瘤分期提供技术参考。在项目实施过程中，综合运用多种电子显微镜、电化学技术、纳米组装等多种实验手段，探究了金属有机框架材料在电极表面的组装条件及稳定性，金属有机框架材料与电极表面修饰核酸及电信号传导的影响，金属有机框架材料与外泌体的相互作用，外泌体与蛋白酶—抗体逻辑体系的联系，多通道微流控电分析装置的构建以及蛋白酶诱导的金属有机框架材料的降解等多种因素。通过对这些检测条件的摸索，在优化的条件下，我们从灵敏度、选择性、使用成本、可靠性等多个指标综合评价，初步证实了检测方法在缓冲液体系和人工模拟样本分析中的可行性，所构建的方法可以很好地检测出多种乳腺癌细胞系分泌的外泌体。另外，我们还证明了联合分析乳腺癌外泌体表面的两种蛋白质标记物和一种microRNA标志物可以显著提高乳腺癌的早诊率，为肿瘤的早筛早诊提供了新的技术手段。在项目研究过程中，我们也提出了一些其他检测肿瘤标志物的新方法，现已正式发表标注有国家自然科学基金（81802978）的SCI论文7篇，其中第一作者或通讯作者5篇，申请专利1项，完成项目的既定目标。