基于微尺度DNA编程界面及合金纳米二聚体串联组装的肿瘤外泌体RNA多元超灵敏SERS分析

Aberrant exosomal RNAs are closely associated with tumor occurrence, metastasis and recurrence. In this project, we will tactfully integrate microfluidic chip, DNA nanotechnology, rolling circle amplification (RCA) and surface enhanced Raman scattering (SERS) into a simple system for the multiplex and ultrasensitive analysis of ovarian cancer exosomal RNAs. By constructing program-controlled solution delivery system, cancer exosome is separated and lysed in the magnetic control zone of microfluidic chip. The target RNAs in exosome lysates can be efficiently and specifically captured by DNA-programmed nanostructured probes in capture zone. Structured circular probes containing the DNAzyme sequence are designed to specifically recognize and cleave target RNAs for the generation of 3′ terminals to initiate subsequent RCA reaction. This target primed amplification doesn’t require added primers, and avoid primer-induced non-specific amplification. Long single-stranded DNA amplified products with repetitive sequence are obtained to accurately regulate DNA-functionalized alloy nanoprobes for the direct formation and tandem assembly of nanodimers with sub-nano gap. This method significantly improves the SERS signal, and achieves the multiplex, ultrasensitive, highly specific and rapid analysis of ovarian cancer exosomal RNAs. With minor modification of DNA probes, it can be readily expanded to the detection of other cancer, and eventually provide new ideas and methodological basis for cancer early diagnosis, therapeutic evaluation and prognosis.

异常外泌体RNA与肿瘤发生、转移及复发密切相关。本项目拟通过微流控芯片、DNA纳米技术、核酸滚环扩增和表面增强拉曼散射（SERS）的巧妙设计及优势整合，以卵巢癌为研究对象，发展外泌体RNA多元超灵敏分析方法。构建一体化溶液传递系统，通过程序化控制，在微流控芯片磁控区分离并裂解外泌体；DNA精确编程的纳米探针捕获功能区高效、特异地从连续传递的裂解液中捕获多元靶标RNA；设计的DNAzyme结构环形探针双向且专一地结合并酶切该RNA，产生3′末端引发滚环扩增，避免外加引物导致的非特异性扩增；利用合金纳米颗粒表面核酸探针与重复序列扩增产物的精确互补杂交，调控形成亚纳米间隙等离子二聚单元及其串联组装体，显著增强SERS信号，从而实现卵巢癌外泌体RNA的多元、超灵敏、高特异、快速检测。简单调整核酸探针，此法可拓展用于其他肿瘤，以期为其早期诊断、预后评估及治疗监测提供新思路与方法学基础。

外泌体RNA的异常表达与肿瘤发生、转移及复发密切相关，是临床早期诊断或预后监测的潜在标志物。本项目通过整合微流控芯片、功能纳米金探针、核酸扩增技术和表面增强拉曼散射（SERS），以乳腺癌为研究对象，建立外泌体RNA超灵敏的在线分析方法。主要研究内容与重要结果包括：. 1、设计并制备多种具有独特三维结构的SERS基底，其中基于蒲公英状Ag/WO3-x 微纳米结构复合材料的增强因子高达1.4×107；仙人掌结构的银枝晶/硅针尖纳米复合材料的增强因子高达6.6×107； 基于ZnO纳米阵列负载纳米金催化硅纳米线丛林结构的增强因子高达8.7×107。. 2、组装并调控功能纳米金探针，将分子识别与信号放大模块体化集成在纳米金颗粒上，避免了低效的自由扩散与组装过程，在扩散受限的粘性拥挤环境中加速了反应动力学，实现了单细胞内RNA、蛋白等多靶标的精准检测。. 3、设计微流控芯片，在线捕获并裂解外泌体，被释放的内源RNA通过链置换作用产生可被聚合酶识别的3′末端引发滚环扩增，并结合多个标记生物素的信号探针。链霉亲和素-辣根过氧化物酶识别并结合生物素，可在过氧化氢存在时，催化纳米金表面酪胺生成活性中间体，并共价结合到周围蛋白的富电子表面形成酪胺化复合物，大量富集成以辣根过氧化物酶为中心的聚集团，显著增强SERS信号，可实现108个外泌体中RNA的超灵敏、快速检测。. 本项目在研期间共培养博士研究生10人，其中4人已于项目在研期间顺利毕业；硕士研究生7人，其中2人已于项目在研期间顺利毕业。相关研究成果已发表SCI论文20篇，申请国家发明专利8，其中已有6项获得授权。本项目的完成将为微量提取样本中外泌体RNA的快速、灵敏、在线分析提供新方法，为肿瘤的早期诊断、预后评估、治疗监测和复发检测提供新思路。