基于多价核酸适体和"DNA多腿滚球机器人"电化学传感技术的肺癌外泌体microRNA检测方法研究

In order to address the issue of low accuracy in the case of biomarkers in tumor exosomes, the project firstly intends to adopt DNA self-assembly technique to prepare multivalent aptamer modified super-paramagnetic beads. Using a combination reaction between aptamer and membrane protein of exosomes and magnetic field, lung cancer exosomes can be captured and separated from serum with high selectivity. Upon addition of lock nucleic acid labeled complementary sequences, the intact exosomes will be released mildly. Secondly, the exosomes is broke efficiently and quickly and release the target miR-205 under the low voltage electric field. Then, the target will induce primer exchange reaction cascade to extend multiple DNA sequences on the microspheres surface, so as to prepare "DNA multi legged rolling robot" to achieve the first amplification of target signals. Thirdly, a electrochemical detection system is developed based on the robot. Through the cycle of chain replacement-dissociation-hybridization reaction between the DNA orbital probes and the"robot legs", the "non-bridge-burning" rolling of the robot is carried out to achieve the target signal's amplification again. Finally, a highly sensitive and selective, mild and inexpensive liquid biopsy method will be established for the detection of miR-205 in lung cancer exosomes. The above research work is expected to provide a reference for the study of exosomes and its content, so that it can be used for early diagnosis and prognosis monitoring of tumor.

针对肿瘤外泌体内容物中标志物检测准确性较低的问题，本项目首先拟采用DNA自组装技术，制备多价核酸适体修饰的超顺磁珠，利用适体与外泌体表面膜蛋白的结合和磁场，高特异性捕获、分离血清中的肺癌外泌体。再利用适体与其锁核酸修饰的互补序列的杂交反应将外泌体温和完整地释放。其次，使用低压电场将外泌体高效快速地破碎并释放出靶标miR-205。然后，采用靶标诱导的引物替换级联反应，在微球表面延伸出多条DNA序列，以制备“DNA多腿滚球机器人”，实现靶标信号的第一重放大。最后，构建基于该“机器人”的电化学检测系统，通过“机器人腿”与电极上DNA轨道探针的链替换-解离-杂交-链替换的连锁反应，进行非“烧桥”式的滚动，实现靶标信号的再次放大。最终，建立一种用于肺癌外泌体内容物miR-205检测的高灵敏、高特异性、温和、价廉的液体活检新方法。有望为外泌体及其内容物的研究提供借鉴，使其能用于肿瘤早期诊断和预后监测。

肺癌是全世界范围内发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一，提高其生存率的关键是进行早诊早筛。以外泌体及其内容物miRNA作为生物标志物的液体活检技术在癌症早筛领域有着重要的意义。但癌症早起阶段，肿瘤细胞来源的外泌体及其内容物miRNA含量较低，特异性捕获与灵敏检测的难度较大。为此，本项目基于核酸适配体技术、DNA级联信号放大技术、DNA自组装技术、自制合成的吖啶酮衍生物及纳米材料开发了几种电化学和光学生物传感器用于外泌体及其内容物中miRNA的检测，主要包括以下几个方面：（1）利用相关软件优选出有最佳结合能力、最适结合位点的核酸适配体，并将其用于外泌体的捕获和检测。（2）通过核酸适配体功能化的电极将外泌体捕获，并利用DNA自组装技术进行信号放大，实现了外泌体的灵敏检测。（3）自制合成的吖啶酮衍生物同时具有电化学、双光子荧光、可见光诱导氧化酶模拟和光电化学活性，基于这些性质，构建了几种用于肿瘤外泌体及其内容物miRNA检测的多模式生物传感器。（4）在电极界面构建了具有良好稳定性和防污染能力的HT-poly-A组装层，结合DNA级联信号放大技术，实现了外泌体miRNA的灵敏检测，检测限低至aM级别。这些研究建立了多种高灵敏、高特异性的外泌体及其内容物miRNA的检测策略，并在优化的条件下，对其灵敏度、选择性、重现性、稳定性等多个指标进行考察，初步证实了它们的应用价值。另外，将这些方法应用于实际样本的检测，成功实现了对肿瘤患者与健康人临床血清样本的区分。本项目的研究为外泌体及其内容物miRNA的检测提供了新的思路，为深入以外泌体及其内容物为生物标志物的液体活检技术的研究提供了理论和技术支持。