苏云金芽胞杆菌L-赖氨酸2,3-氨基变位酶与杀虫晶体蛋白形成的关系及调控作用机制研究

Bacillus thuringiensis (Bt), which produces Cry insecticidal crystal proteins (ICPs), is a kind of environmental friendly biopesticide which possess a specific insecticidal activity to targeted insects and widely used for control of agricultural and forestry pests. It has important academic value and application prospect to study the regulatory mechanism of the key functional proteins of Bt in the formation of ICPs.According to the preliminary research results of Bt 4.0718 on genome sequence, genome annotation, transcriptional and proteins expression level of different growth phases, a series of potential key functional proteins had changed their expression abundance along with the ICPs formation, gene of L-lysine 2,3-aminomutase(L-LAM) was selected to be knocked out and reverse mutated to aquire a L-LAM gene deletion strain and a reverant, then a quantitative comparative proteomic analysis based on iTRAQ labeled will be used between L-LAM gene delection strain and original strain at diffrent growth phases to study the difference of proteome causeed by L-LAM gene, confocal laser scanning microscopy(CLSM) and atomic force microscope(AFM) will be used to observe the the form of crystal protein, then verify the relationship and their regulatory mechanism of interaction between L-LAM and the formation of ICPs by pull-down and western blot. Our study is aimed at establishing a platform of genomics, proteomics and protein interactions of Bt strain, revealing the regulation mechanism of ICPs formation, improving the ability of Bt strain to produce ICPs and providing the basis for constructing efficient broad-spectrum insecticidal engineered bacteria.

苏云金芽胞杆菌（简称Bt）能产生Cry类杀虫晶体蛋白，是一种环境友好型生物杀虫剂，广泛应用于农林业害虫控制。研究Bt中重要功能蛋白与杀虫晶体蛋白形成的调控机制，具有重要的学术价值和应用前景。根据前期本室筛选的Bt4.0718基因组测序和注释、不同生长时期转录和蛋白质表达水平的研究结果，发现了一些潜在的重要功能蛋白在晶体形成过程中伴随表达丰度的变化趋势，选取其中关键的 L-赖氨酸2,3-氨基变位酶基因进行基因敲除和回复突变、利用iTRAQ定量蛋白质组学技术比较基因敲除前后菌株不同生长时期全蛋白质组的差异，激光共聚焦和原子力显微镜观察晶体蛋白形态，结合pull-down和western blot验证此酶与杀虫晶体蛋白形成的关系及相互作用的调控机制。旨在建立一个Bt菌株蛋白质组学和蛋白质相互作用技术平台，揭示晶体蛋白形成的调控机制，为提高Bt产晶体蛋白能力和构建高效广谱杀虫工程菌奠定重要基础。

苏云金芽胞杆菌（简称Bt）能产生Cry类杀虫晶体蛋白，是一种环境友好型生物杀虫剂，广泛应用于农林业害虫控制。研究Bt中重要功能蛋白与杀虫晶体蛋白形成的调控机制，具有重要的学术价值和应用前景。根据前期对本室筛选的Bt4.0718菌株基因组测序和注释、不同生长时期蛋白质组的研究结果，发现了一些潜在的重要功能蛋白在芽胞和晶体蛋白形成过程中其表达丰度随之变化。首先成功的敲除了 L-赖氨酸2,3-氨基变位酶基因（L-lam）,构建了回复突变株，克隆了L-lam基因，经PCR和测序鉴定，获得了成功表达，并用qRT-PCR和Western blot验证。相差显微镜和扫描电镜比较观察了它们的表型、生物学特性及其杀虫活性；对L-lam基因敲除菌株与原始菌株的iTRAQ定量蛋白质组学的鉴定，差异蛋白的筛选统计、GO、KEGG等生物信息学分析，绘制了L-赖氨酸2,3-氨基变位酶与其它功能蛋白之间的相互作用网络图，在此基础上分析发现L-lam基因主要通过调控核糖体、氨基酸合成和三羧酸循环途径来影响杀虫晶体蛋白的形成。在完成对苏云金芽胞杆菌4.0718菌株的基因组学和蛋白质组学比较分析后，继续寻找与L-lam相关联的功能基因，在原始菌株中敲除了与L-赖氨酸2,3-氨基变位酶相关联的琥珀酸半醛脱氢酶基因（gabD）和与芽胞、杀虫晶体蛋白形成相关的重要功能基因spoIVA、hsp20，比较了gabD、spoIVA、hsp20基因敲除前后菌体的表型、杀虫生物活性，发现它们对芽胞和杀虫晶体蛋白形成具有重要影响；iTRAQ定量蛋白质组鉴定了它们的差异表达蛋白，分析了gabD、spoIVA、hsp20基因对芽胞和杀虫晶体蛋白形成的关系，并获得它们的回复突变株；异源表达L-lam、groEL、groES、gabD、spoIVA、hsp20基因，制备了相应的抗体并进行了Western-blot验证。建立了激光共聚焦技术平台对GroEL、GroES伴侣蛋白与杀虫晶体蛋白的相互作用进行了观察,为更好地揭示芽胞晶体蛋白形成的调控机制，提高Bt杀虫毒力和构建高效广谱杀虫工程菌奠定重要理论基础。