苏云金芽胞杆菌功能蛋白质组学及新型杀虫蛋白质分子的研究

苏云金芽胞杆菌（简称Bt）作为对农产品安全和保护生态环境的微生物杀虫剂，其伴胞晶体蛋白是杀虫的主要毒素组分，晶体蛋白质分子种类与其杀虫毒力密切相关。对Bt不同亚种采用改进的纯化伴胞晶体方法，解决晶体蛋白质高疏水性、极易聚集变性和难于酶解等问题，采用一维电泳、双向电泳、多维液相色谱分离与质谱连用技术和蛋白质数据库查询，阐述Bt毒蛋白质组和晶体蛋白形成因子，分析Bt亚种间及不同生长时期蛋白质组的差异，确定全部原毒素分子组成，寻找新型杀虫蛋白质分子，结合基因工程技术获得候选蛋白质的编码基因，阐明晶体形成过程与其它辅助蛋白质的关系,研究毒素分子组与杀虫活性之间的内在联系，揭示晶体蛋白形成机理、结构与功能的关系，对建立一个包括众多有重要功能和学术价值的Bt全毒素蛋白质组的实体库,为寻找和利用新的高毒力杀虫蛋白质基因构建高效广谱杀虫工程菌提供应用基础。

苏云金芽胞杆菌(Bt)伴胞晶体蛋白是杀虫的主要毒素组分，晶体蛋白质分子种类与其杀虫毒力密切相关。本项目首先用1D、2D电泳结合质谱鉴定的方法分析了Bt不同亚种间蛋白质的差异，并对Bt库斯塔克亚种4.0718 菌株营养生长中期（T1）、芽胞前期（T2）和芽胞后期（T3）的菌体全蛋白质进行双向电泳(2-DE)，结合MALDI-TOF/TOF MS，成功地鉴定了包括Cry1Ac(3)、Cry2Aa、BTRX28、免疫抑制因子(InhA)以及InhA 前体等在内的多种杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins, ICP）。结果表明，ICP在芽胞前期开始表达，证实了ICP的产生是与芽胞的形成密切相关，同时，也鉴定到一些与ICP和芽胞形成的相关蛋白，如CotJC、OppA、ORF1及SpoIVA等。为了研究晶体毒蛋白在三个不同时期的形成及蛋白质表达差异，采用蛋白质组学"shotgun"方法，利用2D-LC-MS/MS技术对三个不同生长时期的菌体全蛋白进行了功能蛋白质组学分析，分别鉴定到了918、703及778种蛋白质。这些蛋白质的分子量分布范围为4.6 kDa～477.4 kDa、pI为4.01～11.84。并依据KEGG及BioCyc代谢途径数据库，对这些蛋白质进行了功能分类和功能蛋白质组学分析。鉴定了三个毒蛋白(Cry2Aa,、Cry1Aa和Cry1Ac)以及一系列潜在的细胞内活性因子，发现了一些新型杀虫蛋白质分子，calY (Genbank号：EU604076) 、vip3 (Genbank号：DQ497637)和cry2Ac(Genbank号：ABC74793 )。此外，还鉴定了一些对ICP形成具有重要作用的蛋白质，主要是芽胞形成蛋白、辅助蛋白及分子伴侣蛋白等，利用Western blot验证了CotJc和谷氨酰胺合成酶。2-DE提供了同一蛋白在不同生长时期可靠的相对定量信息，而"shotgun"方法则突破了传统2-DE对具极端等电点和分子量大小蛋白质的不易检测的限制，二者结合可极大地扩大Bt毒蛋白质组学数据库，为阐明ICP的形成机制和功能蛋白质组学研究提供理论依据。此外，利用同源重组的方法构建了几株杀虫毒力较高的菌株，研究了几种杀虫活性毒蛋白分子的靶标昆虫受体蛋白，为利用新的高毒力杀虫蛋白质基因构建高效广谱杀虫工程菌提供了应用基础。