AMPK-SIRT1/mTOR能量信号通路与肉鸡骨骼肌热应激效应关系及EGCG调控机制

The heat stress induces the change of energy metabolism from growth to maintenance and causes the heat stress response, which is the main reason of decreasing production in poultry. And what does the molecule mechanism between change of energy metabolism and heat stress response? This study clarifies the relationship between varies of AMPK-SIRT1/mTOR signal pathway and heat stress response (mitochondrial biogenesis, ROS production, change of antioxdative system, HSP expression and cell oxidation) induced by heat stress in the skeletal muscle satalite cell and AA chicken. This research also elucidates the mechanism of phosphorylation and deacetylation of upstream and AMPK-SIRT1/mTOR signal pathway regulating target gene related to heat stress response with the methods of specific inhibitors and RNAi technology. This study also analysis the effects of heat stress and EGCG on the expression and promotor activity of PGC-1α and AMPK with the method of co-immunoprecipitation and reporter gene assay. The above research conclusions show the molecule mechanism of which AMPK-SIRT1/mTOR signal pathway regulates the heat stress response in cell. EGCG also enhances the functions of self-guard via energy signal pathway, which contribute to alleviate the heat stess in the skeletal muscle satalite cell and AA chicken.

热应激引起骨骼肌能量代谢发生变化的同时，也引起细胞热应激效应，这是热应激使家禽生产性能下降的主要原因。热应激所诱导的骨骼肌能量代谢变化与热应激效应的关系及其分子机制是什么？本项目拟以肉鸡骨骼肌卫星细胞和AA型肉鸡为研究材料，首先研究了热应激引起的骨骼肌AMPK-SIRT1/mTOR能量信号通路变化与细胞热应激效应（线粒体生物合成、ROS产生、抗氧化体系变化、HSP表达及细胞氧化程度）的关系，其次使用特异抑制剂、RNAi技术分析了AMPK-SIRT1/mTOR信号通路及其上游关键因子通过磷酸化或去乙酰化对热效应目的基因的调节机制，并使用免疫共沉淀和启动子报告基因分析技术研究了热应激对AMPK、PGC-1α表达及其启动子活性的影响，通过这些研究阐明了AMPK-SIRT1/mTOR能量信号通路调控细胞热应激效应的分子机制。同时也证明EGCG正是通过该能量信号通路缓解家禽骨骼肌热应激。

热应激引起骨骼肌能量代谢发生变化的同时，也引起细胞热应激效应，这是热应激使家禽生产性能下降的主要原因。EGCG是茶多酚的主要活性成分，具有很强的抗氧化性能。本研究主要是探讨热应激对骨骼肌卫星细胞AMPK-SIRT1/mTOR信号通路的影响及EGCG调控效应、热应激及EGCG 通过LKB1/AMPK信号对骨骼肌卫星细胞抗氧化性能的调控机制、阐明了EGCG对热应激肉鸡生长性能、血液生化指标、肌肉抗氧化性能、肝脏抗氧化性能、肠道抗氧化性能的调控效应以及AMPK/SIRT1-PGC-1α调控机制。研究结果表明，热应激条件下，肉鸡的体重、日增重和日采食量显著降低（p<0.05），血清、肝脏、空肠粘膜、肌肉的GSH-Px、SOD、CAT活性。热应激肉鸡添加600 mg/kg EGCG后，体重、日增重和日采食量显著增加，血清、肝脏、空肠粘膜、肌肉的GSH-Px、SOD、CAT活性SOD、GSH-Px和CAT活性显著增加。热应激显著降低了35日龄肉鸡血清总蛋白、葡萄糖含量、血清碱性磷酸酶的活性，而显著增加了尿酸、胆固醇、甘油三酯含量，以及肌酸激酶、乳酸脱氢酶活性和谷草转氨酶活性（p<0.05）。热应激肉鸡补充EGCG 600 mg/kg 后，显著增加了热应激肉鸡血清葡萄糖、肉鸡碱性磷酸酶，而显著降低了血清胆固醇、甘油三酯含量以及乳酸脱氢酶活性、肌酸激酶、谷草转氨酶显著下降。热应激使肝脏和肠道粘膜p-AMPKα、Sirt1、PGC-1α及UCP3、Nrf2蛋白表达和肠道PGC-1α、SOD1、GPx1、Nrf2 和NOX2 mRNA表达水平显著下降，以及HSF1和NOX2蛋白表达和HSF1、HSP70、UCP3 mRNA表达水平（P<0.05）显著增加（P<0.05）；热应激肉鸡添加300 mg/kg、600 mg/kg EGCG后，上述蛋白和基因表达明显改善。细胞研究结果表明，EGCG可以显著提高热应激肌细胞GPX1、SOD1、Nrf2、AMPKa及PGC1-a基因及Nrf2及PGC-1a蛋白的表达，而使用LKB1抑制剂Radicicol、AMPK抑制剂Compound C、LKB1 SiRNA、AMPK SiRNA后，显著抑制了这些基因和蛋白的表达。免疫共沉淀分析表明，EGCG处理组MO25与LKB1的免疫共沉淀蛋白表达显著高于HS组，而ELS组MO25与LKB1的免疫共沉淀蛋白