基于督脉与脊髓走行功能一致性从Wnt信号通路探讨循督脉电针对基因修饰干细胞移植的导向作用

Cell transplantation for treatment of spinal cord injury is the most close to the clinical method, but on how to maximize the axon regeneration after transplantion throng glial scar barrier to the injured distal nerver pathway establish new ways at present there is no effective.Previous study showed that the injured spinal cord of Dumeridian electroacupuncture can effectively promote nerve regeneration after transplantion of olfactory ensheathing cells and promote regeneration of nerve fibers through the scar.So we put forward the hypothesis:Based on the consistency of the governor vessel and walking and spinal cord function,ancupuncture may enhance regeration on Du axons with direction of the guiding role of nerve target organ.In order to verify the hypothesis that spinal cord injury SD rat model we modified stem cell transplantion as the reserch object,the Wnt pathway as astarting point,using immnohistochemical technique,Weste- rnblot gene modification,chenical and other means,the expression of cell markers GFAP+BrdU,NF-200+BrdUDOdouble staining of neural stem cell transplantion,to explore the influence on neuronal differentiation and axon guidance and the mechanism of dry acoupuncture group double gene modiffied neural.The aim of this study is to provide new ideas and experimental basis for how to promote the orderly growth of regenerating axons and effectively break through the scar formation.

细胞移植是目前最接近临床的脊髓损伤治疗方法，但对如何使移植后再生的轴突最大限度地突破胶质瘢痕的阻挡到达损伤远端建立起新的神经传导通路目前尚无有效的办法。本课题组前期研究表明督脉电针能有效的促进嗅鞘细胞移植后受损脊髓神经纤维的再生并促进再生神经纤维穿越瘢痕。因此我们提出假说：依据督脉与脊髓走行及功能的一致性，循督脉针刺可能具有促使再生的神经轴突有方向性地导向神经靶器官的作用。为验证假说，我们以双基因修饰干细胞移植的脊髓损伤SD大鼠模型为研究对象，以Wnt信号通路为切入点，采用基因修饰技术、免疫组织化学、Westernblot等手段，观察神经干细胞的标记物GFAP+BrdU、NF-200+BrdU双重染色的表达，探讨督脉电针干预双基因修饰的神经干细胞移植对神经元分化及轴突导向的影响及其作用机制。为脊髓损伤细胞治疗中如何促进再生轴突的有序生长并有效突破角质瘢痕提供新思路和实验依据。

应用干细胞移植治疗脊髓损伤可以从本质上逆转受损的脊髓神经组织，但对如何使移植后再生的轴突最大限度地突破胶质瘢痕的阻挡到达损伤远端建立起新的神经传导通路目前尚无有效的办法。本课题组前期研究表明督脉电针能有效的促进嗅鞘细胞移植后受损脊髓神经纤维的再生并促进再生神经纤维穿越瘢痕。因此我们提出假说：依据督脉与脊髓走行及功能的一致性，循督脉针刺可能具有促使再生的神经轴突有方向性地导向神经靶器官的作用。为验证假说，我们以双基因修饰干细胞移植的脊髓损伤SD大鼠模型为研究对象，以Wnt信号通路为切入点，采用基因修饰技术、BBB评分、免疫组织化学及Westernblot检测β-Catenin、GFAP的表达情况，探讨督脉电针干预双基因修饰的神经干细胞移植对神经元分化及轴突导向的影响及其作用机制。故本次实验成功利用慢病毒载体构建了LV-rHIF1α-OE及LV-rGDNF-OE，并使其在体外具有高效转染NSCs的能力，24h即可发现有目的基因表达，随着时间推移，转染率逐渐升高，72h时后可见大量表达，转染率超过90%，证明转染后的NSCs能够高效过表达目的基因HIF-1α、GDNF，在模型制备后立即利用微量注射器在伤段缓慢注射移植5ul的GDNF、HIF-1α双基因修饰的NSCs悬液，使NSCs的生物学特性在GDNF、HIF-1α优化修饰下，可以耐受缺血缺氧的不利环境，防止神经元萎缩，提高NSCs的存活率与增殖、分化能力。且基于督脉与脊髓走行一致及总督一身之阳气，电针督脉不仅可直达病所，又可温通经络、疏通血脉，结合GDNF、HIF-1α基因修饰NSCs移植的治疗方式可有效改善大鼠SCI后脊髓组织的病理状态，调节Wnt信号通路，上调β-Catenin的表达，抑制GFAP的过表达，减少细胞凋亡及瘢痕增生，增强细胞增殖能力，诱导轴突再生，促进脊髓神经功能水平和肢体运动功能的恢复，这为脊髓损伤的治疗提供了一种新的思路方法和实验依据。