弓形虫TCTP介导宿主炎性反应的分子机制研究

Toxoplasmosis is an important transmissible parasitic disease between human and animal. The pathology of Toxoplasma acute infection is associated with excess production of inflammatory mediators, signifying that the disease is due to excessive inflammatory immune responses. Excessive inflammatory immune responses led to a series of serious pathological changes and promote the development of the disease. The translationally controlled tumour protein (TCTP), also called histamine-releasing factor, is a class of highly conserved proteins. Plasmodium falciparum TCTP (PfTCTP) can stimulate the host basophils and mast cells to release histamine, and that promotes the pathological changes and the inflammatory response. T. gondii TCTP (TgTCTP) and PfTCTP are highly homologous protein. But so far there is no report about the TgTCTP. This laboratory has performed an initiatory identification for the TgTCTP. The specific fluorescence stained by anti-TgTCTP polyclonal mouse antibodies under confocal laser scanning microscopy indicated the localization of TgTCTP in the cytoplasm of T. gondii. TgTCTP could be secreted to the outside of the parasites. TgTCTP knockout parasites display invasion and growth inhibition in vitro. In this project, the pathogenicity of knockout parasites, the histamine-release activity and the active domain of TgTCTP, and the mediated effects in host inflammatory reactions will be explored on the basis of previous works.

弓形虫病是一种重要的人畜共患寄生虫病，弓形虫的严重感染往往伴随着过量炎性介质的产生，过度的炎性免疫反应导致了一系列严重的病理变化，促进了疾病的发生。翻译控制肿瘤蛋白（TCTP）又叫组胺释放因子，是一类高度保守的蛋白。疟原虫TCTP能够刺激宿主嗜碱性粒细胞和肥大细胞释放组胺，从而促进炎性反应的发生和疾病的恶化。弓形虫TCTP（TgTCTP）与疟原虫TCTP具有高度的同源性，但目前为止并未见到有关弓形虫TCTP的文献报道，本研究室已经对TgTCTP进行了初步鉴定，证明TgTCTP定位于速殖子的胞浆内并且能够分泌到虫体外侧，通过基因敲除的方法证明TgTCTP的缺失导致虫体侵入和复制受到了明显的抑制，本项目将在前期工作的基础上验证TgTCTP的缺失对于弓形虫致病性的影响，同时检测TgTCTP在体外和体内的组胺释放活性，分析TgTCTP的功能区域，探讨TgTCTP介导宿主炎性反应的分子机制。

自噬是细胞的一种主要代谢方式，涉及多个真核生物中的存活促进过程，对于细胞的生长有着重要作用。弓形虫在饥饿的条件下具有明显的自噬特征，在感染宿主细胞后也可以引起宿主细胞的自噬，一方面宿主细胞能够通过自噬清除虫体，另一方面弓形虫能够诱导并调控宿主细胞的自噬，从而促进自身的生长。翻译控制肿瘤蛋白（TCTP）是一种功能广泛的保守蛋白，有研究显示TCTP能够调控细胞的自噬，而目前为止并未见到有关弓形虫（Tg）TCTP特征及功能的报道。我们的前期研究发现，强毒株（RH）TgTCTP的转录水平及表达量都要高于弱毒株（PLK）；TgTCTP定位于弓形虫的胞浆内，并且随着虫体的分裂生长定位没有发生变化；我们使用CRISPR/Cas9技术构建了TgTCTP的敲除及补回虫株，表型分析显示TgTCTP的敲除抑制了虫体在宿主细胞内的生长和复制，却促进了虫体逸出的效率；体外表达的TgTCTP以二聚体或三聚体的形式存在，序列分析显示在TgTCTP蛋白序列中的两个半胱氨酸可能是形成聚合体的关键位点；依据相关文献我们制备了弓形虫ATG8（TgATG8）的抗体并且构建了弓形虫的自噬模型；TCTP能够跟ATG5复合物相互作用，而弓形虫的基因组中也存在着ATG5的同源基因，我们体外扩增并在293T细胞中对TgATG5进行了表达，为验证TgATG5复合物与TgTCTP的相互作用奠定了基础。在宿主细胞内，我们首先证明TgTCTP能够分泌到虫体外侧，其次将TgTCTP转染293T细胞，TgTCTP显示了促进LC3脂化的作用。因此我们推测TgTCTP很可能通过调控虫体及宿主细胞的自噬系统，从而促进了虫体自身的生长。因此对TgTCTP功能及特征的研究将为TgTCTP在虫体自噬以及宿主细胞自噬中的功能解析以及TgTCTP在虫体生长过程中的作用奠定基础。