FSTL1-DIP2A信号通路在血管发育与血管稳态维持过程中的作用机制研究

TGF-β signaling plays a pivotal role in normal blood vasculature development and in maintaining vessel homeostasis. FSTL1 was found to antagonize TGF-β super family signaling, and during late developmental stage FSTL1 was mainly expressed by endothelial cells and mural cells. DIP2A was discovered as a FSTL1 receptor recently by two separate groups from Japan and USA. Further experiments showed DIP2A was expressed on endothelial cells and could mediate FSTL1 downstream signaling. Our hypothesis is that FSTL1-DIP2A signaling pathway may interact with TGF-β signaling pathway and regulate blood vasculature development as well as homeostasis maintenance. Before DIP2A was found, we have generated the Fstl1 knockout(KO) mice and digging the mechanism in the ligand side. Now and in this proposal, we will use genetic approach to generate both conventional and conditional Dip2A KO mice and in the receptor side to study the biological function of FSTL1-DIP2A signaling pathway. We will try to answer whether DIP2A is a biological functional receptor of FSTL1 in vivo. Whether FSTL1-DIP2A signaling pathway could interact with TGF-β signaling pathway and involved in regulating normal blood vasculature development and homeostasis maintenance. We will further analyze which cell type, endothelial or mural cell mediate this signaling transduction and will isolate primary cells from both mutant and control mice. The downstream signaling components and targets of DIP2A will be revealed through RNA-Seq technique as well as cell and molecular biology approach. Our research will offer new information and genetic models for vascular biology study and might be able to find new targets for treating vascular disease caused by TGF-β malfunction.

TGF-β信号通路在血管发育与血管稳态维持过程中起重要作用。FSTL1在多方面显示出拮抗TGF-β超家族信号转导的生物学效应，在发育后期主要表达于血管内皮细胞与血管壁细胞。DIP2A作为FSTL1的受体日前分别被日本与美国的研究组发现，进一步的实验显示DIP2A在内皮细胞介导FSTL1的下游信号转导。我们认为FSTL1-DIP2A信号通路很可能调节TGF-β信号通路而影响血管发育或血管稳态的维持。本研究将从受体角度出发，建立Dip2A的完全基因敲除与组织特异性基因敲除小鼠，用遗传与发育生物学方法在体内验证并回答：DIP2A是否为FSTL1的受体，FSTL1-DIP2A信号途径是否对血管的发育与维持起作用，是否调节TGF-β信号通路，并进一步解析该信号通路的生物学功能由哪一类细胞介导。我们将分离Dip2A基因敲除小鼠及野生型小鼠的血管内皮细胞和(或)血管壁细胞，研究DIP2A的下游信号通路。

生物学研究与临床数据均显示Fstl1具有重要的功能，包括调节免疫反应，保护并促进缺血后心肌再生，调控并影响BMP，Tgf-β信号通路从而影响众多的生物学过程。虽然Fstl1的作用是公认的，但是其起作用的具体而明确的机理还不清楚。作为一个分泌蛋白，FSTL1 是否有受体，其受体是谁一直没有答案，直到2010 年，来自日本和美国的两个研究小组分别通过免疫共沉淀与酵母双杂交的方法发现DIP2A(Disco-interacting protein 2 homolog A)是FSTL1 在内皮细胞的膜受体。. 本研究主要利用基因工程小鼠模型在体内验证Fstl1-Dip2a信号通路是否存在，以及Dip2a如何介导Fstl1起作用。..从KOMP购买的小鼠Dip2a敲除的胚胎干细胞株虽然培养正常，但是嵌合率80%的首建鼠并没有生出Dip2a缺失的小鼠，显示干细胞失去全能性。我们利用Crispr-Cas9技术，自己摸索并建立了低成本、高效、快速的基因敲除与敲入技术平台。我们制备了Dip2a基因敲除小鼠，敲除了Dip2a基因的所有编码区（约65kb）。我们还制备了Dip2a的LacZ报告基因敲入小鼠，精确地将LacZ插入到Dip2a的ATG起始密码子上，无缝且最为真实的模拟Dip2a在小鼠体内的表达。我们通过基因型鉴定，荧光定量PCR，Western-blot等方法，确定了Dip2a敲除小鼠与Dip2a LacZ敲入小鼠都没有Dip2a的mRNA以及蛋白的表达，证明模型制备是成功的。但是Dip2a缺失后小鼠并没有发育异常，即便完全回交到B6背景后，这一点与Fstl1基因敲除小鼠不同，所以体内模型显示Dip2a并不是Fstl1的生物学受体。我们也进行了部分体外实验，无论是在N端还是在C端将GFP融合在小鼠Dip2a上均未发现Dip2a有膜定位。LacZ报告基因小鼠显示Dip2a只在成年时表达于特定部位的静脉内皮细胞与血管平滑肌细胞，如大隐静脉、尾静脉，而绝大多数血管内皮细胞并不表达Dip2a。所以Fstl1对血管系统的影响应该不是由Dip2a所介导。对Dip2a-LacZ小鼠从胚胎发育到成年组织的LacZ染色显示，Dip2a在胚胎期主要高表达于神经系统，在成年后在多组织都有特异性表达。这些结果提示Dip2a在神经系统中很可能有重要的功能。