丹参转录因子SmWRKY14介导茉莉素调控丹参酮类化合物合成机制研究

Tanshinones are main active ingredients of Salvia miltiorrhiza which induced by phytohormone Jasmonates(JA), however the regulation mechanism is still unknown. Our previous studies found that SmCOI1 gene participated in the JA-induced tanshinone synthesis and SmWRKY14 was SmCOI1 dependent JA-responsive gene which had the ability to activate the key enzymes in tanshinones synthesis, via screening the transcriptome data between SmCOI1 silencing lines and wildtype. According we speculate that SmWRKY14 mediates JA-induced tanshinone accumulation. In this proposal, to identify the regulatory effects of WRKY14 on the synthesis of tanshinones, we firstly compare the expression levels of genes involved in tanshinones biosynthesis and concentrations of tanshinones in over-expression and CRISPER-Cas9 knockout transformed plants. Then,we will validate the transcriptional activation effects of SmWRKY14 on the key genes in tanshinones biosynthesis pathway using DNase I footprinting, electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and transient promoter activation assays. Our studies aim to uncover the mechanism of JA-induced tanshinones biosynthesis process via SmWRKY14. The success of proposal will provide clues for signal transduction and response mechanisms of JA-regulated plant secondary metabolism and provide strategies for molecular breeding of medicinal plants.

丹参酮是丹参重要药效成分，其生物合成受茉莉素(JA)调控，但调控机制尚不明确。课题组前期研究发现，COI1参与JA诱导丹参酮合成；分析JA处理COI1沉默株转录组信息发现丹参WRKY14依赖COI1应答JA，并对丹参酮合成关键酶基因有潜在转录调控效应。据此，我们推测丹参WRKY14介导JA调控丹参酮积累过程。本项目拟通过比较SmWRKY14基因超表达和CRISPER-Cas9敲除转化植株中丹参酮合成通路关键酶基因的表达丰度及丹参酮类化合物含量，明确SmWRKY14对丹参酮类化合物合成的调控作用；利用DNA酶I足迹法、凝胶迁移率和启动子激活瞬时系统筛选验证WRKY14调控的靶基因，阐明SmWRKY14对丹参酮合成途径关键酶基因的转录调控效应；从而揭示WRKY14介导JA调控丹参酮合成过程的分子机制。研究结果将为JA调控植物次生代谢的信号转导与应答机制提供线索，同时为药用植物分子育种提供依据。

丹参酮是丹参重要活性成分，其生物合成受茉莉素(JA)及其下游转录因子WRKY14的调控，但调控机制尚不明确。为阐明丹参WRKY14对丹参酮合成积累的调控作用，我们通过构建SmWRKY14基因超表达（OE）和CRISPER-Cas9敲除（KO）植物表达载体，利用遗传转化法获得过表达和敲除的转基因丹参植株。并比较转基因植株中丹参酮合成通路关键酶基因的表达丰度及丹参酮类化合物含量，明确了SmWRKY14对丹参酮类化合物合成的调控作用；同时还发现丹参WRKY14对丹酚酸类化合物的积累也有调控作用。在过表达和敲除株系中检测了丹参酮和丹酚酸合成通路关键酶基因的表达量，结果显示，丹参酮合成关键酶基因GGPPS、CPS1、CYP76AH1在OE株系中表达量显著高于对照，且在KO株系中显著低于对照，显示出与WRKY14的表达量正相关；丹酚酸合成通路上的酶基因PAL、C4H1、TAT1、RAS1具有与WRKY14表达量正相关的表达模式，表明WRKY14对这些酶基因的表达有调控作用。为进一步阐明WRKY14调控丹参酮及丹酚酸合成的机制，我们利用LUC转录激活系统与酵母单杂系统筛选验证WRKY14调控的靶基因，丹参WRKY14是通过与RAS1和CPS1启动子直接结合，调节二者的转录水平，从而调节丹参酮和丹酚酸合成累积的。.综上，我们提出茉莉酸调控丹参次生代谢过程的分子机制：当丹参中茉莉酸信号启动（环境因子、非生物、生物胁迫等诱导）后，茉莉酸信号诱导WRKY14表达升高，WRKY14作为转录调控因子结合于其靶基因RAS、CPS，调节他们的转录水平从而影响丹参酮与丹酚酸的积累过程。这些发现为JA调控植物次生代谢的信号转导与应答机制提供线索，同时为高品质丹参分子育种提供依据。.在研究中我们发现过表达WRKY14的OE株系较野生型有更高的抗旱性，我们推测WRKY14可能还调控丹参抗逆过程。为继续深入研究其中的机制，在本项目资助下，我们开展了丹参抗逆基因筛选鉴定工作。基于丹参基因组数据库，我们鉴定、分析了CAX、DHAR、MDHAR三个抗性相关的基因家族，并对其成员进行了生物信息学及表达模式分析，发现其中的基因对环境胁迫、激素诱导有不同的响应模式。作为抗性调节的候选基因，它们的鉴定为进一步了解丹参抗逆分子机制提供了研究依据。