基于ASCT2介导的Gln-ROS-NLRP3途径探究奥美拉唑增强顺铂抗肿瘤作用机制

Chemosensitivity is a key problem to be solved in the current anti-tumor study. NLRP3 inflammasome, a regulatory factor in tumor proliferation and apoptosis, can be activated by intracellular reactive oxygen species (ROS). The intracellular level of glutamine (Gln) is closely related to ROS accumulation, which may be a potential regulatory pathway to activate the NLRP3 inflammasome. The applicant found that omeprazole could enhance the anti-tumor effect of cisplatin synergistically via up-regulating the levels of ROS and NLRP3 in vivo and in vitro. The expression of glutamine transporter ASCT2 and the content of Gln in cells were decreased when co-treated with omeprazole and cisplatin. So we hypothesized that omeprazole could enhance the anti-tumor effect of cisplatin via the ASCT2-mediated Gln-ROS-NLRP3 pathway. The applicant intends to use RNA interference technology to obtain the ASCT2 overexpressed HepG2 cells and tumor-bearing nude mice. Various techniques were employed to verify the hypothesis. This study provides theoretical support of omeprazole on the principle of conventional drug in new use, and has important instructional significance for the clinical application of the two drugs.

肿瘤细胞对化疗药物敏感性下降是目前肿瘤治疗面临的重大难题。Nod样受体蛋白3（NLRP3）能够被细胞内活性氧（ROS）激活，在肿瘤凋亡中发挥重要作用。细胞内谷氨酰胺（Gln）的缺乏导致ROS蓄积，是NLRP3激活的潜在调控因素。申请人前期研究表明，奥美拉唑可使细胞内Gln缺乏，并伴有ROS和NLRP3水平升高，在动物和细胞中协同增强顺铂抗肿瘤作用。细胞内Gln的摄取依赖于Na+依赖性中性氨基酸转运体（ASCT2），申请人发现肿瘤细胞内Gln含量下降与奥美拉唑抑制ASCT2的表达有关，可能是其激活NLRP3的重要原因。因此本课题提出假说：奥美拉唑能够通过ASCT2介导的Gln-ROS-NLRP3途径增强顺铂的抗肿瘤作用。申请人拟运用RNA干扰技术获得ASCT2过表达的HepG2细胞，在体内外验证该假说，为奥美拉唑在临床的“老药新用”提供理论支持，对两者的临床应用具有重要的实际指导意义。

顺铂用于多种实体肿瘤的治疗，但具有明显的肾毒性，奥美拉唑常用于缓解化疗患者的胃肠道反应。前期研究发现奥美拉唑能够减轻顺铂所致肾毒性，发挥“减毒增效”作用。申请人深入探究了奥美拉唑减轻顺铂肾损伤的保护机制，同时考察其协同增强顺铂抗肿瘤的作用机制，各部分工作均在动物水平和细胞水平进行了验证。首先申请人构建了2种荷瘤小鼠模型：A549/顺铂耐药荷瘤裸鼠模型和H22荷瘤小鼠模型；通过生化检测、免疫组化、Western Blot、ELISA等方法确定了奥美拉唑的协同增效作用；奥美拉唑联合顺铂能够抑制肿瘤组织中ASCT2转运蛋白的表达和NLRP3炎症小体组装，使NLRP3、Caspase 1和ASC等蛋白表达减少最终诱导细胞凋亡；申请人采用质粒转染的方法构建了ASCT2过表达的HepG2细胞，进一步验证了ASCT2对于NLRP3炎症小体组装的调控作用。此外申请人深入探究奥美拉唑对顺铂所致肾损伤的保护机制，发现在肾脏组织中奥美拉唑能够抑制TLR4/NF-kB/NLRP3信号通路的激活，继而减轻炎症反应。申请人进一步采用HPLC-QTOF/MS对小鼠尿液、血清、肿瘤组织和肾脏组织进行代谢组学分析，发现苯丙氨酸、嘌呤代谢等体内代谢通路与奥美拉唑改善顺铂耐药密切相关；而顺铂所致肾损伤与氨基酸代谢、脂质代谢和能量代谢异常有关；申请人通过定量分析筛选出4个生物标志物与肾损伤关联密切，敏感性高，有望进一步开发为顺铂肾损伤的辅助检测指标。最后，申请人基于NLRP3在顺铂抗肿瘤及肾毒性中的角色和作用，对多个可能对顺铂存在“减毒增效”作用的物质进行了筛选，开展了相关研究验证其作用机制并发表相关文章。综上，本阶段的研究深入阐明奥美拉唑协同增效的作用机制，对于两者的临床治疗应用具有实际指导意义。此外本研究也发现了NLRP3在肿瘤与炎症中的双重作用，其作用机制仍有待进一步阐明，申请人将继续对此进行深入研究。