基于PKCδ介导的自噬调控探究黄葵胶囊对顺铂肾毒性的保护作用及分子机制

Cisplatin nephrotoxicity has become the most difficult clinical adverse reaction, thus how to prevent and treat cisplatin nephrotoxicity has become a consensus problem in the field of cancer treatment, and there is no effective western medicine. Studies have found that PKCδ mediated autophagy played an important role in the pathogenesis of cisplatin nephrotoxicity. Huangkui Capsule (HKC) has been approved for treatment of nephritis, and has been confirmed effective in improving renal inflammation and renal function. Our pre-experimental found that HKC could attenuate cisplatin nephrotoxicity and promote cell autophagy while inhibit the overexpression of PKCδ effectively. However, it is not clear whether HKC exerts its protective effect in cisplatin nephrotoxicity through regulation of PKCδ mediated autophagy. In this study, we will (1) use cell and animal model to confirm the protective effect of HKC on cisplatin nephrotoxicity; (2) use various molecular biological methods to study the effect of HKC on related protein expression involved in PKCδ mediated autophagy; (3) use PKCδ/AKT/mTOR pathway inhibitor /agonist and interference techniques to explore the regulation mechanism of HKC on PKCδ mediated autophagy. Our project will elucidate the molecular mechanism of HKC on cisplatin-induced nephrotoxicity, and will provide scientific basis for the clinical wider application of HKC.

顺铂肾毒性已成为临床最棘手不良反应，如何预防和治疗顺铂肾毒性已成为癌症治疗领域的共识难题，且尚无有效西药。已有研究发现，蛋白激酶Cδ(PKCδ)介导的自噬调控在顺铂肾毒性的发病机制中发挥重要作用。黄葵胶囊已被批准用于肾炎的治疗，在改善肾脏炎症及肾功能方面疗效确切。申请者前期预实验发现黄葵胶囊可有效减轻顺铂肾毒性并促进细胞自噬过程，同时能够抑制PKCδ的过表达，但PKCδ介导自噬调控在黄葵胶囊肾保护中的作用机制尚未明确。本项目拟在细胞及动物水平对黄葵胶囊的肾保护作用进行确证；同时运用多种分子生物学手段，研究黄葵胶囊对PKCδ介导自噬调控相关蛋白表达的影响；并采用通路抑制剂或激动剂、干扰技术，从PKCδ/AKT/mTOR通路深入探讨黄葵胶囊对PKCδ介导自噬的调控机理。本项目的顺利实施，不仅能够阐明黄葵胶囊对顺铂肾毒性发挥保护作用的分子调控机制，亦为黄葵胶囊在临床更广泛的应用提供科学依据。

项目背景：顺铂是临床最有效和常用的一线化疗药物，但其使用会对肾脏产生损害，使得顺铂肾毒性成为临床最棘手不良反应，但针对顺铂肾毒性尚无有效防止方案。深入揭示顺铂肾毒性的发病机理，并找寻有效降低顺铂肾毒性的防治方案尤为迫切。黄葵胶囊(HKC)是一种已上市药物，临床广泛用于治疗慢性肾病及肾病综合征等多种肾脏疾病，并取得良好疗效。本项目开展HKC对顺铂肾毒性的干预作用及其机制研究，有望成为抗顺铂肾毒性潜在药物。.研究内容：荷瘤小鼠顺铂肾毒性模型的建立及药物处理；检测小鼠肾组织病理损伤、糖原沉积及胶原沉积；试剂盒检测小鼠BUN、CRE及血清胱抑素C水平；Western blot和RT-PCR检测小鼠肾组织KIM-1及NGAL的蛋白表达；检测小鼠肾组织及血清中炎症水平；检测小鼠肾组织凋亡及自噬相关蛋白表达；HPLC对HKC的主要成分进行分离、鉴定；检测化合物对顺铂诱导小鼠肾小管上皮细胞(RTECs)活力影响；流式细胞仪检测细胞凋亡；ELISA检测干扰自噬对受试化合物调控RTECs细胞炎症因子分泌影响；Western blot检测受试化合物对RTECs细胞NF-κB通路相关蛋白表达影响；Western blot研究过表达自噬对NF-κB p65核表达的影响。.结果和数据：联用HKC不影响CP的抗肿瘤效应；HKC可抑制小鼠肾组织病理损伤、糖原及胶原沉积，并抑制小鼠血清中BUN、CRE及血清胱抑素C水平；HKC可促进小鼠肾组织KIM-1及NGAL的蛋白及mRNA表达；HKC可抑制顺铂诱导的小鼠肾组织凋亡及炎症，并促进肾组织自噬。使用HPLC从HKC中分离并鉴定出四种单体化合物，分别为芦丁(RUT)、金丝桃苷(HY)、异槲皮苷(IQT)及槲皮素(QRT)；四种化合物中只有HY和IQT能够抗CP所致RTECs细胞活力下降；HY和IQT均能抑制CP诱导RTECs细胞炎性因子的分泌并促进RTECs细胞自噬；干扰自噬可减弱HY和IQT的抗炎能力；HY和IQT均能够抑制细胞核NF-κB p65的蛋白表达，但对NF-κB p65总蛋白表达均无明显影响；HY和IQT抑制NF-κB p65核表达的能力依赖于其对自噬的调控过程。.科学意义：本研究初步揭示HKC抗顺铂肾损伤的效应及机制，对于推动HKC在临床的广泛应用，进而解决临床应对顺铂肾毒性无有效药物的现状，具有重要的社会意义和经济价值。