胰腺癌侵袭转移特异性microRNA的筛选及其靶基因的鉴定

2008年胰腺癌位居癌症致死原因的第4位，高侵袭性和高转移性是治疗失败的主要原因。本组发现不同癌前病变来源导管癌侵袭转移性不同，microRNA表达有明显差异。推测microRNA与胰腺癌侵袭转移密切相关。microRNA微阵列芯片初筛，实时RT-PCR比对有无转移的导管癌中microRNA的表达量，确定与转移相关的候选miR217。原位杂交分析其细胞内分布及与癌前病变的关系。通过敲低或过表达，确定其对胰腺癌细胞株侵袭转移能力的影响，在裸鼠体内促进胰腺癌远处转移的作用。根据预测软件的交集探寻可能的靶基因MAPK1，荧光素酶表达载体鉴定靶位点，RT-PCR定量分析MAPK1mRNA表达量，Western blot确定MAPK1蛋白表达量，免疫组化鉴定靶蛋白，确定miR217调控的MAPK1与转移相关性。探寻胰腺癌侵袭转移特异性microRNA及对其靶基因的阐释将为胰腺癌的诊治提供新靶点新方法

本课题的前期研究发现不同癌前病变来源导管癌侵袭转移性不同，microRNA表达有明显差异。推测microRNA与胰腺癌侵袭转移密切相关。microRNA微阵列芯片初筛出miR31与miR217为备选，定量RT-PCR研究发现在有淋巴结转移的胰腺导管癌,无淋巴结转移的IPMN起源导管癌及周围正常胰腺组织中分别定量分析miR-217,发现三组间存在显著性差异。miR217在导管内乳头状肿瘤（IPMN）中的表达也随上皮细胞的异型程度而改变,但始终高于导管腺癌的表达水平。正常胰腺组织的表达明显高于前二者。确定与转移相关的候选miRNA为miR217。经过原位杂交分析，发现其细胞内分布于细胞核，与癌前病变的关系密切。在癌前病变导管上皮内瘤变（PanIN）2~3 中 miR217 表达降低，导管腺癌表达消失，且比周围正常胰腺组织差异最明显。在新鲜胰腺肿瘤标本中，通过冰冻切片检查与显微切割方法，分离IPMN, PanIN及DAC 细胞，确定在癌前病变PanIN3中miR217 表达降低。.基于实验验证的miR-217的靶基因,我们分析之后认为KRAS、NR4A2和IRS 1是三个比较可信的靶基因候选。其中KRAS已被证明和胰腺癌的调控相关,而IRS1是和肿瘤的产生相关的。将miR-217靶基因预测的结果和上述基因表达谱差异分析的结果结合起来,从而找到在IPMN和导管癌中最可能的受miR-217调控的靶基因IRS1。.在进行mir217靶向调节靶基因IRS1功能鉴定中，扩增靶基因IRS1全长3′UTR序列或部分序列,构建到psiCHECHK 2载体上。根据生物信息学预测的mir217和靶基因IRS1的 3′UTR的结合序列信息,构建突变载体psiCHECHK鉴定靶位点。.RT-PCR定量分析IRS1mRNA表达量，发现表达量与淋巴结转移相关，高表达组淋巴结转移增多，低表达组淋巴结转移少。免疫组化鉴定IRS1蛋白定位于细胞浆及细胞膜，在有淋巴结转移的胰腺癌原发灶中弥漫强表达于癌细胞浆，在癌前病变PanIN中灶性表达于异型上皮细胞胞浆或胞膜。在IPMN中灶性表达于胞膜,并随上皮的异型程度增加而增强。由此确定miR217调控的IRS1与胰腺癌转移密切相关。探寻胰腺癌侵袭转移特异性microRNA217及对其靶基因IRS1的阐释将为胰腺癌的诊治提供新靶点新方法.