囊泡运输调控蛋白FREE1参与植物应答ABA和盐胁迫信号的分子机制研究

Vesicular transport system is responsible for intracellular transport of proteins and other cargoes to the specific parts of a cell, and is widely involved in the regulation of plant growth and environmental responses. However, the post-translational modifications of vesicular transport regulators and the biological functions of such modifications are still lack of in-depth study in plant. This proposal intends to study the regulation and function of post-translational modifications of FREE1, a plant unique vesicular transport regulator, in the plant response to ABA and salinity stresses. Our study includes the regulatory mechanism of FREE1 phosphorylation, FREE1 protein phosphorylation sites and functional analysis, subcellular localization change of FREE1 protein, the identification of FREE1 interaction partners and their functional studies in nucleus. We will focus on the regulatory mechanism of FREE1 phosphorylation and the functions of FREE1 after phosphorylation, and eventually we will clarify the molecular function of FREE1 in the regulation of plant responses to ABA and NaCl stress signals. This study will reveal the new function of plant vesicular transport regulators in the regulation of plant responses to environmental stimuli. In addition, this study can contribute to our knowledge of the signal transduction network of ABA and salinity stress in plants and thus provides the theoretical basis for the improvement of crop resistance to environmental stresses.

囊泡运输系统负责将细胞内的蛋白质等货物分子运至细胞的特定部位，因而广泛参与植物的生长发育和环境应答。然而植物中囊泡运输调控蛋白本身的翻译后修饰及其生物学功能尚缺乏深入研究。本项目拟以植物中独有的囊泡运输调控蛋白FREE1的翻译后修饰及其生理功能研究为切入点，从分子细胞及遗传等多个角度研究植物脱落酸（ABA）和盐（NaCl）胁迫信号响应中FREE1蛋白磷酸化修饰的调控、FREE1蛋白的磷酸化位点及其功能分析、FREE1蛋白亚细胞定位的变化以及细胞核内FREE1互作蛋白的分离和功能分析，重点研究FREE1蛋白磷酸化修饰的调控机制及磷酸化后行使的功能，最终阐明FREE1调控植物响应ABA和NaCl胁迫信号的分子机制。本研究将揭示植物囊泡运输调控蛋白在调控植物环境应答方面的全新功能，并将丰富植物ABA信号转导和盐胁迫响应调控网络的研究，为农作物的抗逆改良提供理论依据。

囊泡运输是真核细胞内负责大分子物质转运的重要“物流系统”，广泛参与植物生长发育和环境应答。然而植物中囊泡运输调控蛋白本身的翻译后修饰及其生物学功能尚缺乏深入研究。本项目以植物特有内膜转运调控必需复合物（ESCRT）组分FREE1的翻译后修饰及其生理功能研究为切入点，主要探究FREE1蛋白磷酸化修饰及其调控植物非生物胁迫的功能和机制。本项目研究表明：1）植物胁迫条件（脱落酸处理或盐胁迫）下，SnRK2.2和SnRK2.3两个蛋白激酶与FREE1蛋白互作，并调控FREE1蛋白C末端530和533两个丝氨酸位点的磷酸化修饰；2）磷酸化的FREE1蛋白进入细胞核与ABA信号途径的两个重要转录因子ABF4和ABI5互作，并抑制它们的转录激活活性，从而逆向调控ABA信号；3）利用CRISPR-Cas9技术获得一个FREE1蛋白入核缺陷型突变体free1-ctmut，该突变体中FREE1蛋白C-末端序列缺失导致FREE1蛋白不能发生磷酸化修饰和进入细胞核，最终导致free1-ctmut突变体对ABA超敏感；4）free1-ctmut abf4以及free1-ctmut abf5两个双突变体均表现为与abf4和abi5类似的对ABA不敏感的表型，说明在ABA信号转导途径中ABF4或ABI5这两个基因位于FREE1的下游。综上，本研究阐明了FREE1蛋白磷酸化修饰及其响应和调控植物ABA信号的分子机制。以上核心研究结果于2019年以研究论文（research article）发表于国际主流期刊《Nature Plants》。此外，本项目还总结和概述了植物ESCRT复合物功能方面的研究进展和研究趋势，相关论文发表在国际主流期刊《Trends in Plant Science》。本项目资助共发表SCI收录论文9篇，专著章节2篇，培养博士后1名，博士2名，硕士3名。本项目研究结果首次发现了植物囊泡运输调控因子FREE1在细胞核内参与调控基因表达的全新功能，说明囊泡运输途径和植物环境应答信号可能在基因表达和蛋白转运等多个层面存在交叉调控关系，为阐释和理解真核生物囊泡运输途径的多功能性提供了有力证据。ABA广泛参与调控植物干旱胁迫等逆境响应，本项目研究结果有助于我们进一步理解植物ABA信号转导调控网络，为将来应用生物技术和分子辅助育种技术改良作物抗性提供了潜在应用基础。