血凝性脑脊髓炎病毒S蛋白与易感细胞结合的分子机制

猪血凝性脑脊髓炎是由血凝性脑脊髓炎病毒（HEV）引起仔猪呕吐、衰竭或者明显的神经症状为主要临床特征的一种急性、高度接触性传染病，死亡率高达20%-100%。HEV属于冠状病毒属的成员，其表面纤突（spike, S）蛋白上的受体结合域（receptor binding domain, RBD）与细胞表面受体的结合是冠状病毒侵入细胞的关键环节。本课题在原有工作基础上，拟通过现代生物信息学方法分析S蛋白RBD的结构域；根据体外表达S蛋白的功能分析结果，对其功能区做进一步的肽扫描，以确定S蛋白与HEV易感细胞的结合位点及其氨基酸序列；进而对RBD蛋白在HEV感染细胞过程中的作用进行验证，阐明S蛋白与易感细胞结合的分子机制。该研究不仅为揭示HEV的分子致病机制提供理论依据，而且HEV S蛋白RBD的确定，还可作为设计猪血凝性脑脊髓炎疫苗的理想候选对象，为该病治疗性抗体及各种抑制剂等的研发奠定基础。

猪血凝性脑脊髓炎病毒属于冠状病毒属成员，其具有较高的神经毒性。本课题组前期研究结果发现，该病毒上的S蛋白能够与神经粘附分子（NCAM）发生相互作用，NCAM可能是HEV的神经受体。将S蛋白S1功能域分为三段S1-291，S277-794 和 S548-868进行克隆表达与纯化，进而通过Pull-down和酵母双杂交的方法，筛选能够与NCAM结合的片段。结果表明，S277-794 蛋白片段与NCAM能够结合。在此基础上，依据生物信息学分析结果，将S277-794 蛋白片段分为5段，通过两次酵母双杂交试验验证，结果表明S441-457能够与NCAM发生结合。为了进一步确定RBD氨基酸组成，将S441-457分为交叉重叠的五段，每段包含16个氨基酸残基，每条寡肽段末端加6-His标签，进行生物合成，最后通过Pull-down方法筛选出与NCAM结合的最小蛋白片段，为一段包含16个氨基酸残基的多肽，目前正在做进一步的验证。这一区域的发现，为阐明HEV的分子致病机制奠定基础，对于将来设计含有RBD重组载体疫苗提供依据。