环状RNA靶向调控内质网应激介导蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的机制研究

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a fatal disease with high mortality and unfavorable outcomes. Early brain injury following SAH is considered as the primary cause of poor outcome after SAH. Our previous study demonstrated that protein synthesis dysfunction caused by Endoplasmic reticulum stress play an important role in early brain injury after SAH. Circular RNAs (circRNAs) are a special type of endogenous noncoding RNAs which are widely involved in promoting rolling circle translation, controlling transcription of parent genes, helping to form alternatively spliced mRNA. The journal Nature have published an issue discussing the important role of circRNAs in human diseases, and attracted great attentions. Our previous study with circRNAs microarray have profiled a large number of altered circRNAs in SAH rat, which would be a promising target to regulate Endoplasmic reticulum stress after SAH. This study is undertaken to investigate the role and mechanism of circRNAs targeting endoplasmic reticulum stress in early brain injury following SAH in both animal and cellular levels, with techniques as CRISPR/Cas9 and RNA immunoprecipitation. This study was designed to clarify the mechanism of early brain injury after SAH and provide new strategy for SAH treatment.

蛛网膜下腔出血（SAH）是严重危害健康的疾病，它引发的早期脑损伤是其首要的致病机制。本项目组前期研究发现，内质网应激引发的蛋白质合成与加工异常在SAH后早期脑损伤中发挥着重要作用，但其具体机制尚不明确。环状RNA作为调控蛋白质合成与加工的重要机制，受到国内外研究的热切关注，Nature等权威杂志于近期专题综述了其重要的生理意义。本项目组最新的预实验应用基因芯片对大鼠SAH模型进行初步测序，研究结果显示大量环状RNA的表达水平在SAH发生后产生了显著改变，是富有前景的内质网应激上游调控机制研究方向。本研究组拟采用SAH整体与离体模型，构建环状RNA实相表达谱，综合运用生物信息学方法筛选分析目标环状RNA，应用CRISPR/Cas9、RNA结合蛋白免疫沉淀等技术阐明特异性环状RNA调控内质网应激的具体作用机制。本项目是对前期研究课题上游机制的深入探索，为临床治疗SAH提供新思路和理论依据。

出血性脑卒中是严重危害健康的疾病，它引发的早期脑损伤是其首要的致病机制。本项目组前期研究发现，内质网应激引发的蛋白质合成与加工异常在SAH后早期脑损伤中发挥着重要作用，但其具体机制尚不明确。环状RNA（circRNA）作为调控蛋白质合成与加工的重要机制，受到国内外研究的热切关注。研究团队应用大鼠出血性脑卒中模型，采用Arraystar 芯片高通量测序揭示了脑卒中发生后circRNA的表达变化情况。应用Cluster、TreeView等软件对circRNA测序原始数据开展差异基因筛选与聚类分析，筛选出差异性表达一致性高、显著性差异强的目标circRNA。综合采用Targetscan、miRanda、miRDB这三个具有不同算法特点的数据库进行联合预测，分析目的circRNA调控miRNA的结合位点特征，将三者交集作为预测候选靶基因。对目的circRNA进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能注释与富集分析，描述其发挥的分子功能、所参与的生物过程、所属的细胞组成，鉴定出具有显著富集的GO Term。联合应用DAVID生物信息数据库与Pathway Studio软件进行特定circRNA相关信号通路分析，利用Cytoscape软件构建可视化circRNA-miRNA-靶基因交互作用网络图，直观分析其关联性。在此基础上，研究团队在脑卒中模型大鼠与原代培养神经元脑卒中体外模型中，对芯片测序获得circRNA结果进行功能验证。应用实时荧光定量PCR（Real time PCR）、荧光原位杂交（FISH）、Northern blotting等技术筛选、鉴定与内质网应激机制密切相关的circRNA。明确了脑卒中早期脑损伤相关性circRNA的生物信息学特征，筛选出特异性目标circRNA（Rap1，Ras，MAPK，PI3K-Akt，TNF与Wnt），揭示其调控miRNA的具体性状；对测序分析获得Rap1，Ras，MAPK，PI3K-Akt，TNF等信号传导通路，开展脑出血研究的功能验证研究。证实STING、Dectin-1等关键分子通过特异性circRNA调控相关信号通路介导脑卒中早期脑损伤机制，为临床治疗脑卒中提供新思路和理论依据。