心肌细胞IPC保护中Efp介导的14-3-3/pkc复合物泛素化解离作用研究

Our previous studies have shown that PKCε is targeted mitochondria by 14-3-3η which play a protective role in IPC. This project is designed to the mechanism of 14-3-3η/PKCε complex dissociation after IPC. We will assess the interactions between Efp, 14-3-3η and ubiquitin using co-immunoprecipitation, GST-pulldown and double labeling immunofluorescence. Then we'll compare differences in ubiquitinate dissociation of 14-3-3η/PKCε complex at high (≥200% of normal level), low (≤ 50% of normal level ) and levels of Efp in IPC. In addition, we will investigate whether IPC-induced Efp increase is accompanied by changes in downstream targets and whether this is depend upon estrogen. Finally, we'll test if the in vitro results can be reproduced in animals. This project will be instrumental to our understanding of 14-3-3η pathway in IPC and identify the role of Efp in cardiac myocytes. It will also identify new drug target for myocardial protection.

我们前期研究已证实在IPC保护作用中，14-3-3η可与PKCε相互作用，帮助后者向线粒体迁移，发挥心肌保护作用。本项目综合前人与自身研究结果，探讨在上述过程后，14-3-3η/PKCε复合物解离的方式。拟首先在cos7细胞中用免疫共沉淀、GST-pulldown和双标记免疫荧光法初步确认Efp、14-3-3η和泛素之间的相互作用；继而观察在心肌细胞IPC过程中高表达（≥正常表达200%）、低表达（≥正常表达50%）和正常水平Efp对泛素化及14-3-3η/PKCε复合物解离的影响；探讨IPC诱导的Efp上调对下游靶蛋白的调控是否领带于雌激素；并在整体动物水平验证以上实验结果，观测Efp对IPC保护效应的影响。为完善人们对IPC保护作用中14-3-3η信号路径的认识，揭示Efp在心肌细胞中的作用，以期发现新的药物作用靶点，为进一步开发新型心肌保护药物奠定良好的理论与实验基础。

为探讨 14-3-3η 与 PKCε 的解离与 Efp 蛋白之间的关系，我们将pAD/14-3-3η 和 pAD/ Efp 重组腺病毒感染 COS７细胞后，采用免疫共沉淀、GST-pulldow 和双标记免疫荧光法及激光共聚焦显微镜观察到在新生大鼠原代心肌细胞内 Efp 和 14-3-3η 的共定位，证实了二者的相互作用。分别以高表达腺病毒载体 pAD/ Efp 和低表达腺病毒载体 pAD/ Efp-shRNA感染新生大鼠原代心肌细胞后观察到，在 Efp 高表达细胞，14-3-3η/PKCε 的共定位明显减少，反之，在 Efp 低表达细胞，14-3-3η/PKCε 的共定位则增高。pAD/ Efp 和pAD/ Efp-shRNA分别感染新生大鼠原代心肌细胞，４８小时后进行 IPC 处理，并用 MTT 法测定心肌细胞存活率；流式细胞法测定细胞凋亡，结果可见在 Efp高表达组细胞存活率增高，凋亡比例降低，相反，Efp 低表达组，细胞存活率降低，凋亡比例升高。冠脉注射腺病毒建立高表达Efp和低表达Efp的大鼠动物模型，进行IPC处理，检测左心功能、心律失常发生率、心梗面积、心肌酶谱、心肌细胞凋亡和存活率及SOD、GSH-Px表达与活性，结果显示Efp高表达大鼠多项指标优于对照组。本研究提示,在 IPC 保护机制当中，作为分子伴侣的 14-3-3η 帮助 PKCε 到达线粒体之后，Efp 促进 14-3-3η/PKCε解离，继而 PKCε 得以与下游靶蛋白如 VDAC 等结合而发挥生物学活性，而 14-3-3η 回到胞浆继续发挥分子伴侣的靶向定位作用。而 Efp 正是通过这一路径发挥了心肌保护作用。