基于晶体结构设计的，具有吡啶并[2,3-d]嘧啶结构的新型EGFR激酶抑制剂的合成及构效关系研究

EGFR-mediated signal transduction pathways play important roles in the proliferation, invasion, transformation, survival, angiogenesis and metastasis of tumor cells. Osimertinib (AZD-9291) received excellent clinical effect in the treatment of NSCLC as the third generation EGFR inhibitor. Recent clinical studies show that C797S mutation appears after the long-term use of this drug, which will reduce its efficacy significantly. In order to overcome the problem of the drug resistance, our group optimized the structure of AZD-9291 based on the crystal structure of EGFR kinase. At first, we introduced the scaffold of pyrido [2,3-d] pyrimidine to enhance the hydrogen bond interaction between the molecule and the Met-793 residue of the EGFR kinase. Then, various kinds of substitutions were introduced in this molecule to form the hydrogen bonding interaction or hydrophobic interaction with the residues of Ser-797, Met-790 and Arg-841, in order to enhance its binding ability to the EGFR kinase with C797S mutation. On this basis, we designed a series of new compounds with the scaffold of pyrido [2,3-d] pyrimidine and planned to evaluate their inhibitory activities to EGFR kinases and tumor cells in vitro, acute toxicity and antitumor activities in vivo, hoping to get some new candidate compounds with high efficiency and low toxicity, which can overcome the resistance mechanism of C797S mutation.

EGFR介导的信号转导通路在调控肿瘤细胞的生长、侵袭、转化、生存、血管生成及转移的过程中均发挥了重要的作用。Osimertinib（AZD-9291）作为第三代EGFR-TKI在治疗非小细胞肺癌方面疗效显著。但在长期用药后，EGFR激酶会产生C797S突变，使药物的疗效大幅度降低。为了克服耐药性问题，我们基于EGFR激酶的晶体结构对AZD-9291的进行了优化。首先，引入吡啶并[2,3-d]嘧啶结构来加强其与EGFR激酶中Met-793残基的氢键作用，再引入可以与Ser-797、Met-790和Arg-841残基进行氢键结合或者疏水相互作用的基团，加强分子对C797S突变型的EGFR激酶的结合能力。据此，我们设计了一系列具有吡啶并[2,3-d]嘧啶结构的新型化合物，希望能通过体外激酶测试、肿瘤细胞抑制活性测试、急性毒性及体内抗肿瘤活性评价，得到克服C797S突变耐药的高效低毒的候选化合物。

本课题是在上市药物奥希替尼的基础之上，设计并合成了65个具有全新结构的化合物并进行详细的构效关系探索。通过EGFR酪氨酸激酶抑制活性（wild-type，L858R/T790M，L858R/T790M/C797S）、体外细胞水平的抗肿瘤活性（非小细胞肺癌细胞系A549和H1975）测试、细胞凋亡染色实验（AO-EB染色法）、细胞周期凋亡实验、细胞迁移抑制试验和计算机辅助分子对接实验等来评价它们的药理学性质和作用机制，最终得到候选化合物17i、35h和46a。17i为EGFR激酶的不可逆抑制剂，对发生L858R/T790M突变的EGFR激酶显示出优秀抑制活性（IC50=1.7nM）。同时，17i也显示了比奥希替尼更高激酶选择性，其抑制L858R/T790M突变的EGFR激酶的活性为野生型（wild-type）EGFR激酶的22倍，并显示了与奥希替尼相似的浓度依赖性的促细胞凋亡活性，G0/G1细胞周期阻滞和抑制癌细胞迁移的能力，可作为新型的第三代EGFR激酶抑制剂而进一步研究。35h和46a为EGFR激酶的可逆抑制剂。候选化合物35h对wild-type，L858R/T790M和L858R/T790M/C797S型的EGFR激酶的抑制活性分别达到了29nM，10nM和242nM。值得注意的是，35h作为可逆抑制对发生L858R/T790M突变的EGFR激酶显示出了该系列化合物中最高的抑制活性，并显示了浓度依赖性的促细胞凋亡活性和抑制癌细胞迁移的能力。候选化合物46a对wild-type，L858R/T790M和L858R/T790M/C797S型的EGFR激酶的抑制活性分别达到了743nM，42nM和137nM。46a对发生L858R/T790M/C797S突变的EGFR激酶显示了本系列化合物中最高的抑制活性，达到了奥希替尼的3倍。同时，46a几乎不抑制野生型（wild-type）的EGFR激酶，具有较高的激酶选择性，预计可以降低患者发生恶心、皮疹等严重副作用的可能性。综上所述，35h和46a值得作为新一代的对C797S突变有效的EGFR激酶抑制剂的先导化合物进行更加深入的研究。