温和型热应激下胰岛素信号系统在公猪睾丸支持细胞乳酸生成中的分子机制

Lactate is the most important substrate of germ cells for spermatogenesis, as well as enhancing the anti-apoptosis capacity of germ cells. Lactate produced by Sertoli cells is the main resource of lactate during spermatogenesis. Our previous studies showed that mild heat stress enhanced lactate production. Mounting evidence inferred that insulin signaling system is involved in lactate production. However, it is unclear whether heat stress regulates lactate production via modulating insulin-signaling system. Furthermore, it is unclear whether enhancing lactate production is related to testis thermostability. In this project, boars will be used as in vitro and in vivo models by some advanced technologies, including immunohistochemistry, quantitative PCR, Western Blot, immunofluorescence, RNAi and over expression of genes, radioactive labeling techniques, miRNA sequencing, up-regulating and down-regulating the miRNA level in Sertoli cells to analyze the relation of lactate production and thermostability，determine effect and mechanism of Insulin signaling system on heat Stress regulating lactate production in boar Sertoli cells, to search miRNAs which regulate insulin signaling system, and to explain the mechanism of miRNA regulating Insulin signaling pathways. These results will provide a theoretical basis for the therapy of male infertility and new anti-heat stress measures.

乳酸在哺乳动物精子生成中具有十分重要的作用，睾丸支持细胞通过糖酵解途径产生的乳酸是其主要来源，胰岛素信号系统参与了这一过程的调节。我们发现温和型热应激增加了支持细胞乳酸的生成，但热应激是否通过调节胰岛素信号系统影响乳酸的生成以及乳酸是否与睾丸的耐热性有关目前均不清楚。本研究以公猪为研究对象，采用在体和离体热应激模型，利用免疫组化、定量PCR、Western blot、免疫共沉淀、放射免疫标记、免疫荧光、RNA干扰和过表达、miRNA 测序和改变miRNA水平等技术手段，首先通过在体热应激模型和注射乳酸等方法确定乳酸与睾丸耐热性的相关性，然后研究胰岛素信号系统在温和型热应激调节睾丸支持细胞乳酸生成中的作用，筛选调控胰岛素信号转导系统中的作用miRNA并研究其作用机制，阐明温和型热应激如何通过影响胰岛素信号系统的活性调节乳酸生成。本研究将为治疗雄性不育，获得新的抗热应激措施提供理论依据。

乳酸不仅可以作为生精细胞能量代谢的底物，而且具有降低生精细胞凋亡率的作用。本项目利用体外培养的睾丸支持细胞，建立了43℃处理30min的热应激模型，利用这一模型，主要开展了以下研究工作：（1）热应激处理对细胞凋亡与自噬的影响；（2）热应激诱导的自噬在乳酸分泌中的作用；（3）AMPK信号通路在热应激调节乳酸分泌中的作用及机制：（4）HSP70在调节热应激诱导乳酸分泌中的作用及机制；（5）热应激对睾丸支持细胞胰岛素敏感性的影响；（6）热应激如何影响胰岛素的敏感性；（7）热应激对细胞代谢组的变化；（8）花生四烯酸对细胞凋亡及乳酸生成的影响。.我们的结果发现：（1）热应激处理后首先诱导细胞发生凋亡，然后诱导自噬。热应激诱导的自噬具有促进乳酸分泌的作用。（2）热应激通过上调miR-8-3p的表达，抑制AMPK通路的活性，降低了支持细胞间紧密接连蛋白的表达，促进了乳酸的分泌。（3）热应激通过激活ERK1/2信号通路，增加HSP70的表达，促进乳酸的分泌。（4）热应激通过降低miR-7-5p水平促进IRS2的表达,进而增加细胞对胰岛素的敏感性。（5）热应激增加了花生四烯酸的水平，花生四烯酸则促进了细胞的凋亡。这表明，热应激一方面可以通过增加支持细胞对胰岛素的敏感性，激活ERK1/2与PI3K/Akt通路，抑制AMPK通路，促进乳酸的合成；另一方面可以通过增加花生四烯酸的分泌，促进细胞凋亡。由于合成的乳酸一方面为生精细胞提供能量，另一方面也增加了细胞的酸度，降低了细胞的活性。因此，热应激的强度和作用时间会乳酸分泌量和花生四烯酸生产量，进而影响细胞命运。本研究中发现的miR-8-3p、miR-7-5p可以作为调节热应激的靶向分子，但如何将这些小分子RNA应用到临床实践还需要进一步研究。