整合素αvβ3及其配体OPN在胚胎着床中的作用机制研究

胚胎着床是一个复杂的过程，包括定位、黏附、入侵并最终植入子宫内膜。着床成功的必要条件是胚胎的成熟和子宫内膜容受性的建立。许多分子参与调节胚胎着床过程的建立，但详细的分子机制仍不清楚，这对提高助孕技术水平是极大的障碍。整合素αvβ3及其配体OPN是我们课题组前期应用Gene Array 技术筛选出的子宫内膜容受性相关基因，我们的进一步研究证实二者在"着床窗"期子宫内膜组织中明显高表达，且主要由子宫内膜上皮细胞分泌，它们如何调节子宫内膜容受性进而影响胚胎着床的机制是进一步研究的重点。本课题拟通过细胞实验和动物实验，研究雌、孕激素对αvβ3及OPN的调节，应用基因超表达、RNA干扰及特异性抗体阻断技术研究αvβ3及其配体干预后子宫内膜上皮细胞增殖和黏附能力的变化、小鼠胚胎粘附、扩展及宫内着床能力的变化，探讨αvβ3及其配体OPN在胚胎着床过程中的作用机制,为进一步克服早期胚胎丢失提供新途径。

本课题在国家自然科学基金的资助下，成功建立了有效的RL95-2-BeWo球状体共培养体外着床模型，研究不同浓度的雌二醇、孕酮和肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)的刺激对子宫内膜上皮细胞整合素β3及其配体骨桥蛋白表达的影响及其对共培养模型粘附和铺展能力的影响.通过构建整合素αvβ3 真核表达载体，使子宫内膜上皮细胞αvβ3 水平超表达，观察其对胚胎细胞球状体黏附的影响，初步探讨该模型在胚胎粘附-植入方面的多因素调节以及整合素αvβ3 在胚胎着床过程中的可能作用机制，为进一步阐明其在胚胎着床及生殖过程中的功能及分子机制提供实验基础。.方法.1、建立RL95-2-BeWo共培养体外着床模型.2、多因素调节RL95-2-BeWo共培养体外着床模型粘附-植入功能：.3、构建pcDNA3.1-3FLAG-ITGAV、pcDNA3.1-3FLAG-ITGB3真核表达载体，通过脂质体转染人子宫内膜上皮细胞( RL95-2 细胞)。.4、经Real time RT-PCR 检测整合素αv (ITGAV)、整合素β3 (ITGB3)及骨桥蛋白(OPN)的mRNA 表达。.5、经流式细胞术、间接免疫荧光检测ITGAV、ITGB3 的蛋白表达。.6、通过黏附实验观察和分析整合素αvβ3 超表达对胚胎与子宫内膜上皮细胞的黏附情况的影响，经间接免疫荧光检测共培养体系ITGAV、ITGB3 及OPN 的表达。.结果和结论.1、成功建立 RL95-2-BeWo共培养体外模型。.2、整合素β3和OPN在RL95-2单层细胞、BeWo单层细胞和BeWo球状体的细胞质和膜表面表达，其表达受多因素调节。.3、高浓度E2不利于胚胎粘附，高浓度P4和HB-EGF能促进胚胎粘附和植入。.4、成功构建了ITGAV、ITGB3真核表达载体。.5、与单独转染pcDNA3.1-3FLAG-ITGAV、pcDNA3.1-3FLAG-ITGB3相比，ITGAV、ITGB3真核表达载体共转染使RL95-2 细胞的整合素αv、整合素β3表达水平均明显升高。.6、 RL95-2 细胞整合素αvβ3 超表达显著提高Bewo球状体与RL95-2 细胞单层的黏附率，促进Bewo球状体在RL95-2 细胞单层的扩展。.7、整合素αvβ3 和OPN介导胚胎在子宫内膜细胞上的黏附与侵入，在胚胎着床中发挥重要作用。