重离子辐射诱导斑马鱼精原细胞凋亡的线粒体磷酸化蛋白质组调控机制研究

Heavy ion radiation (HIR) has a significant apoptotic effect and can induce damaging mutations in spermatogonia. In order to define the mechanisms underlying induction of apoptosis by HIR in spermatogonia, reference values of spatial and environmental radiation damage assessment and radiation protection are needed. Mitochondria are explicitly involved in programmed cell apoptosis signal transduction pathways. Protein phosphorylation is a reversible process that directly regulates cell signal transduction and apoptosis. However, due to the complexity involved, the mitochondria-mediated apoptosis signaling system has not yet been fully elucidated. Clarifying the function of proteins involved in mitochondria-mediated apoptosis, and building a signal transduction network to define the regulatory role of protein phosphorylation in this process are key goals. Phosphoproteomics approaches may define mitochondrial protein phosphorylation signal transduction networks in zebrafish spermatogonia. These could then be used to elucidate the mechanisms underlying heavy ion-induced apoptosis in spermatogonia. This may in turn facilitate the discovery of important phosphorylated protein regulatory nodes. In addition, this study is of significance for our mechanistic understanding of the effects of HIR-induced damage in reproductive biology more generally. This knowledge could be used to protect individuals exposed to environmental radiation at work, patients undergoing radiotherapy, and astronauts and space travelers.

重离子辐射诱导精原细胞凋亡会产生严重的突变效应，因此，重离子辐射诱导精原细胞凋亡调控机制的研究对空间和环境辐射损伤评估及防护均有实际参考价值。近年来，线粒体在细胞凋亡中的作用被进一步证实，而蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程直接参与细胞的信号转导和凋亡全过程。由于线粒体介导的细胞凋亡的信号传递系统至今未阐明清楚，因此，如何明确磷酸化蛋白在细胞凋亡过程起到的调控作用，是目前急需解决的问题。本项目以磷酸化蛋白质组学为手段，以建立线粒体磷酸化蛋白信号转导网络为切入点，以基于重离子辐射诱导斑马鱼精原细胞凋亡的线粒体磷酸化蛋白质组调控机制研究为主线，以发现重要的磷酸化调控蛋白为重点，对完善重离子辐射诱导精原细胞凋亡的机理研究提供新思路，为揭示精原细胞凋亡导致的疾病机制研究提供理论依据。此外，也为保护辐射环境工作者、放疗病人、宇航员和太空旅行者的健康安全保护提供科学依据。

生理条件下的精原细胞凋亡和增殖平衡对维持精子发生具有重要作用，临床放疗、核事故污染或电离辐射环境会增加精原细胞凋亡，产生突变效应。本项目立足于线粒体凋亡途径，发掘关键线粒体调节蛋白，阐明重离子辐射诱导斑马鱼精原细胞凋亡的内在机制。通过建立斑马鱼精原细胞凋亡模型，构建斑马鱼精原细胞线粒体蛋白表达谱，筛选关键线粒体调控蛋白。结果显示，在辐照后6、12和24小时，随剂量增大（1和4 Gy）和时间增加，生精细胞的凋亡率显著增加。在4 Gy组，精原细胞、精母细胞和精子细胞在辐照后24小时，凋亡增加、增殖能力减弱，说明重离子辐射能够破坏斑马鱼精原细胞的增殖和凋亡平衡。p53、细胞色素c、活化的caspase 3和Bax/Bcl-2的表达水平在1和4 Gy组显著增加，说明重离子辐射能够扰乱精原细胞的线粒体功能，激活p53介导的线粒体凋亡通路，诱导精原细胞凋亡。在辐照后24小时，有60种差异线粒体蛋白在对照和4 Gy组被鉴定出来，对这些差异蛋白进行生物信息学分析，并构建蛋白质互作网络，选取其中鉴定得分最高的20种线粒体蛋白，利用平行反应监测的蛋白质组学技术（Parallel reaction monitoring-based target proteomics，PRM）实现靶蛋白的无抗体验证。有14种蛋白的验证结果与label-free结果一致，说明label-free与PRM技术结合能够实现斑马鱼精原细胞线粒体调控蛋白的鉴定和验证。本研究首次揭示了关键线粒体蛋白在重离子辐射诱导斑马鱼精原细胞凋亡中的潜在作用，并将研究范围扩展到小鼠体内精原细胞凋亡和斑马鱼早期胚胎凋亡研究中，为进一步深入研究精原细胞凋亡机理奠定基础，为理清临床放疗、核事故污染或电离辐射环境对精子发生的影响提供了数据支持，对辐射损伤评估及防护具有实际参考价值。