核糖体蛋白L27a在重离子辐射导致的DNA损伤应答诱发小鼠精原细胞核仁应激中的功能研究

Clarifying the mechanism of heavy ion radiation-induced spermatogonia apoptosis has value in radiation damage assessment and protection. The relationship between the DNA damage response and nucleolar stress in p53 activation has not been elucidated. We hypothesize that the DNA damage response inhibits cap-dependent initiation of protein translation, thus decreasing expression of large subunit ribosomal protein 27a (RPL27a), inducing nucleolar stress, and causing spermatogonia apoptosis. In this project, GC-1 spermatogonia and male mice were irradiated with carbon ions and X-rays. We sought to investigate the effects of heavy ion radiation on the function of RPL27a; to clarify the role of the DNA damage response in inhibiting regulation of RPL27a expression by cap-dependent protein translation initiation; to clarify the roles of RPL27a and RPL5-MDM2-p53; to analyze the ability of the DNA damage response to trigger the nucleolar stress induced by down-expression of RPL27a in spermatogonia, validating the "p53 positive feedback regulation hypothesis." The aim of this project is to explore key pathways linking the DNA damage response and nucleolar stress induced by heavy ion radiation. These findings may then be used to elucidate the mechanisms underlying heavy ion radiation-induced spermatogonia apoptosis, to provide a mechanistic understanding of radiation protection for new radiotherapy technology and space.

明确重离子辐射诱导精原细胞凋亡的机制对重离子安全性评估及防护均有参考价值。DNA损伤应答和核仁应激在p53激活中的关系尚未阐明。我们推测，DNA损伤应答抑制帽依赖的蛋白质翻译起始降低核糖体蛋白L27a（Large subunit ribosomal protein 27a, RPL27a）的表达，诱发核仁应激，导致精原细胞凋亡。本项目采用碳离子和X射线照射GC-1精原细胞和雄性小鼠，探讨重离子辐射对RPL27a功能的影响，理清DNA损伤应答抑制帽依赖的蛋白质翻译起始降低RPL27a的表达，明确RPL27a与RPL5-MDM2-p53的关系，解析DNA损伤应答降低RPL27a表达诱发核仁应激，验证“p53的正反馈调节假说”。研究旨在探寻衔接DNA损伤应答和核仁应激的关键节点，为完善重离子辐射诱导精原细胞凋亡的机理研究提供新思路，为新型放疗技术和空间辐射的防护研究提供理论依据。

电离辐射诱导的精原细胞凋亡是被精密调控的复杂过程，p53在该过程中起核心调控作用。阐明重离子辐射导致的DNA损伤应答激活p53的内在机制，对辐射损伤评估以及辐射防护均有实际参考价值。本项目基于DNA损伤应答诱发核仁应激激活p53的研究设想，阐明核糖体蛋白L27a（Large subunit ribosomal protein 27a, RPL27a）在重离子辐射导致的DNA损伤应答诱发小鼠精原细胞核仁应激中的功能。项目通过碳离子照射小鼠和GC-1细胞，建立精原细胞的DNA损伤和凋亡模型，明确RPL27a表达量降低与p53激活的关系；利用siRNA技术，明确敲低RPL27a对精原细胞凋亡的影响，阐明RPL27a与RPL5和p53的关系；利用同源对接、免疫共沉淀和GST等技术，明确RPL27a与MDM2和RPL5的互作关系；并将研究范围扩展至核糖体蛋白S27a（Small subunit ribosomal protein 27a, RPS27a）在人非小细胞肺癌发生中的作用。结果发现，重离子辐射能够减弱RPL27a与MDM2和RPL5蛋白的结合，增强MDM2与RPL5蛋白的相互作用，激活p53，形成RPL27a-RPL5-MDM2-p53复合物，并调节精原细胞凋亡；敲低RPL27a会增加MDM2、p53、RPL5和p21的表达量，使GC-1细胞发生G1期阻滞和凋亡，同时核糖体大、小亚基的比例发生改变；敲低RPL27a能够诱导GC-1细胞发生p53依赖性的细胞周期阻滞和RPL5依赖性的p53激活；RPL27a与RPL5以及RPL27a与MDM2在体外存在相互作用，敲低RPL27a能够增强RPL5与MDM2的结合作用，抑制p53的泛素化降解，导致精原细胞凋亡；此外，敲低RPS27a能够增强RPL11与MDM2的结合作用，抑制p53的泛素化降解，导致A549细胞凋亡。本研究首次揭示了重离子辐射通过DNA损伤应答诱发核仁应激诱导精原细胞凋亡的分子机制，并将研究范围扩展至重离子辐射诱导肿瘤细胞凋亡的机理研究，对理清重离子辐射生物学效应的内在机制具有重要意义，为明确临床放疗、核事故污染或电离辐射环境对精子发生的影响提供了数据参考，为评估辐射损伤及制定辐射防护措施提供了理论依据。