奶牛脂肪肝病尿液差异表达蛋白筛选

以脂肪酸代谢紊乱、肝脏脂肪蓄积和脂肪变性为病理特征的奶牛脂肪肝病是奶牛重要的群发性常见多发病，严重影响奶牛的生产性能和经济效益。鉴于奶牛脂肪肝病既无特征性临床表现，又无适用的诊断方法，临床早期诊断极为困难，利用蛋白质组学技术可以高通量筛选疾病相关差异表达蛋白的特点，运用比较蛋白质组学、分子生物学和免疫学技术，通过筛选脂肪肝病牛尿液中差异表达的特异蛋白质或多肽，并对其进行分子生物学验证，这些差异表达蛋白可作为脂肪肝病牛非损伤性的特异诊断标志物，为该病的早期诊断、监测和防治提供理论和方法学基础。

本项目运用多平台相结合的蛋白组学技术，重点研究了脂肪肝病奶牛与健康奶牛相较体内差异表达蛋白的筛选，鉴定和验证，并对奶牛脂肪肝病的发病机制进行初步探索。通过奶牛脂肪肝病组和健康组之间的iTRAQ-HPLC-MS、SELDI-TOF-MS实验，结合两组奶牛血清甘油三酯（TG）、β-羟丁酸（BHBA）、葡萄糖（Glc）等生化指标检测，获得如下研究新结果：（1）建立了基于iTRAQ-HPLC-MS和SELDI-TOF-MS蛋白组学技术的奶牛脂肪肝病尿液差异表达蛋白的分析方法，全景式地呈现了差异蛋白的筛选、鉴定、验证以及生物信息学分析的整个过程。（2）运用iTRAQ技术首次获得了奶牛脂肪肝病组与健康组之间的110个差异表达蛋白，其中60个表达上调，50个表达下调；并将生物信息学分析：基因功能（GO）分析，信号通路（Pathway）分析和基因网络（Network）等较好地应用到数据分析中，成功地筛选出了奶牛脂肪肝病的四个关键性调节因子，分别为玻连蛋白（VTN）、载脂蛋白（LCN2）、凝血酶原（F2）和丛集素（CLU）。（3）应用主成分分析（PCA），聚类分析和决策树分析以及常规数据统计分析方法将SELDI-TOF-MS实验中获得的39个差异表达蛋白进行筛选和鉴定，成功确定了脂肪肝病组奶牛体内呈现显著性降低的12种差异蛋白。（4）成功实现了两种组学技术的相互验证，结果显示：两种实验结果出现重叠，具有共同的差异表达蛋白，包括载脂蛋白、淀粉样蛋白、生长因子等，其中有两种蛋白表现高度一致，即骨桥蛋白和血红蛋白β亚基一致表达下调，与健康组相比，脂肪肝病组奶牛尿液骨桥蛋白和血红蛋白β亚基表达量都呈现降低趋势。（5）经过讨论分析，初步证实了四种关键性调节因子F2、VTN、LCN2和CLU可能是奶牛脂肪肝病重要的诊断生物标志物，其中前两种蛋白通过信号通路调节能量代谢，后两种蛋白通过调节运载甘油三酯的极低密度脂蛋白来调控肝脏内的脂肪沉积量。以上研究新成果，从生理、病理以及蛋白组学角度对奶牛脂肪肝病的发病机制进行全新阐释，将为奶牛脂肪肝病的早期检测和诊断提供新的依据。