奶牛脂肪肝病miRNA调控机制的研究

Fatty liver disease is the most common metabolic disease during cows perinatal, the main pathogens is disorder of fat metabolism and tissue damage in liver. In this project, the hypothesis is there exists miRNA which regulates fat metabolism and tissue damage in fatty liver disease. Fatty liver disease cows and cows liver cell model will be used of sample collection; changed miRNA in liver will be filtered by microarray analysis and miRNA target genes will be determined by software prediction and total genome expression microarray analysis;antisense oligonucleotides and eukaryotic expression vector of filtered miRNA will be used in fatty liver cell model to analyze its function by inhibition and overexpression. The expecting result is to define the function and pathway of miRNA in fatty liver disease.

脂肪肝病是奶牛围产期常见多发的代谢病，其主要发病机制涉及肝脏脂肪代谢紊乱和肝组织的损伤。本项目以“奶牛脂肪肝病发生过程中存在调控肝脏脂肪代谢和肝组织损伤的miRNA”为理论假设，以脂肪肝病奶牛和奶牛肝细胞模型为研究对象，运用GeneChip®miRNA芯片筛选出脂肪肝病奶牛差异表达的关键miRNA，利用生物信息学手段预测关键miRNA的靶基因，并与通过牛全基因表达芯片筛选出的奶牛脂肪肝病相关差异表达基因比对，找出关键miRNA的靶基因，分析其与靶基因的关系，最后利用筛选出的关键miRNA反义寡核苷酸及其真核表达载体，使脂肪肝模型细胞相关miRNA表达受抑制或过表达，观察对肝脂沉积和靶基因的影响，进而验证其功能，以期阐明miRNA在奶牛脂肪肝病发生过程中的调控作用和途径，为进一步揭示奶牛脂肪肝病发生机制奠定理论与实验基础。

本项目围绕着奶牛脂肪肝病miRNA的筛选，以自然发病脂肪肝奶牛、脂肪肝病细胞模型和甘草酸单铵盐（mono-ammonium glycyrrhizinate，MAG）干预脂肪肝病细胞模型为研究对象，利用Illumina HiSeq Xten平台进行高通量测序。选取体内和体外表达趋势一致的miRNA作为关键miRNA候选，结果共发现bta-miR-127、bta-miR-129、bta-miR-2387、bta-miR-2440、bta-miR-323、bta-miR-375、bta-miR-432、bta-miR-433、bta-miR-654等9个在脂肪肝/肝细胞模型中上调的miRNA。而单铵盐干预脂肪肝细胞组中这9个miRNA均有不同程度的下降，至此，初步鉴定了奶牛脂肪病的关键miRNA。同时，本项目详细描述了奶牛肝脏的病理学特征，研究发现随着肝脏脂肪含量的升高奶牛肝脏抗氧化能力下降，细胞凋亡增加。细胞模型抗氧化能力变化和自然发病奶牛肝脏呈现相似的特征。在筛选自然发病奶牛的过程中，发现泌乳奶牛脂肪肝的发病率在30%左右。项目还证明了MAG在体外降低奶牛肝细胞脂肪变性的作用，并在产蛋鸡体内得到验证。项目的开展为从miRNA调控的角度阐述奶牛脂肪肝病的发病机制提供了良好的研究基础，同时也为未来应用MAG预防奶牛脂肪肝病提供了理论和实践依据。