提高β-葡萄糖苷酶表达量及其抗高糖反馈抑制能力的基因突变

低活力的β-葡萄糖苷酶是造成酶水解纤维资源得率低、酶用量大、成本高的关键因素之一。克隆和高效表达该酶的基因被认为可以从根本上显著提高其活力的最有效方法。但外源基因在毕赤酵母中表达水平首先受到其内部结构的影响。课题根据毕赤酵母密码子的用法，在不改变所编码氨基酸的条件下，进行β-葡萄糖苷酶基因稀有密码子的突变、A-T序列改造、旁侧序列改造。另一方面，β-葡萄糖苷酶在水解过程中受到葡萄糖的强烈反馈抑制，课题拟通过结构基因的突变将阻遏蛋白失活，降低酶与葡萄糖的亲和力。在此基础上，利用最佳突变基因构建新型高效工程菌株，研究影响其诱导表达的关键因子。本课题首次利用分子遗传工程技术定向改造β-葡萄糖苷酶基因结构，有望能从源头上解除葡萄糖对β-葡萄糖苷酶的反馈抑制，有望能获得适合在毕赤酵母中高量表达的具有自主知识产权的β-葡萄糖苷酶基因序列及其基因工程菌。研究结果将为该酶的规模化制备及其工业应用奠定基础。

β-葡萄糖苷酶外源基因在毕赤酵母中表达水平首先受到其内部结构的影响，在水解过程中受到葡萄糖的强烈反馈抑制。课题研究的内容及主要结果如下：.（1）通过选用在毕赤酵母中使用频率较高的密码子、去除富含GC区和富含AT区域、调整G＋C含量、提高翻译终止效率、保持bgl I基因中的糖基化位点不变等手段和方法，对黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因（bgl I）序列进行了定向进化和突变，CAI从0.64增加到0.84，G+C含量从56.49下降到44.61。.（2）利用生物信息网格平台及相关软件，结合已公布的耐高糖β-葡萄糖苷酶基因序列，对β-葡萄糖苷酶空间结构进行了预测、设计和筛选，了解了反馈抑制位点。同时，利用定点突变技术，有效提高了酶的优良特性。.（3）构建了高效工程菌株，实现了高效表达。在此基础上，通过多拷贝数的构建，大幅度提高了目的蛋白的表达量，表达水平是初发菌株的44.6倍，达到了国际领先水平。.（4）利用建立的基因改造方法，对来源于Aspergillus niger NL-1 的xynB基因进行了克隆、优化、突变、人工合成，实现了在毕赤酵母中的高效表达，最大酶活力达到20424.2 IU/mL，到了国际先进水平；首次克隆并重组表达了黑曲霉菌株（A. niger NL-1）耐高糖β-葡萄糖苷酶Bgl4的基因，耐葡萄糖系数Ki为2 mol/L。.（5）对来源于T.thermosaccharolyticum DSM 571的新型耐高糖β-Glucosidase基因进行了克隆、改造、高通量筛选与高效表达，酶活达到11.2 U/mg。该酶最适反应温度为70℃，最适反应pH为6.4，对高浓度的葡萄糖具有较强的抗抑制物的能力。.申请人已较好地完成了研究任务，并取得了显著的成果。.① 获得了适合在毕赤酵母中高量表达的β-葡萄糖苷酶基因序列，大幅度提高了毕赤酵母表达目的蛋白的水平及其抗高糖反馈抑制的能力。.② 形成了一套比较成熟的β-葡萄糖苷酶分子改造的理论与方法，为进一步改善和提高纤维素酶的生产性能及其活力提供了指导。.③ 培养了1名博士研究生和2名硕士研究生；已申请专利3项，其中获得授权专利1项；在核心刊物上发表研究论文7篇，其中被SCI收录的论文5篇。.研究结果为该β-葡萄糖苷酶的规模化制备及其工业应用奠定了基础。