β-葡萄糖苷酶耐受葡萄糖的分子机制研究

β-Glucosidase is the rate-limiting component of cellulase for efficient degradation of cellulose. Glucose-tolerant β-glucosidase can significantly improve the cellulose conversion, but the underlying mechanism of glucose-tolerance remains unclear. Recently, we obtained four β-glucosidases with high glucose-tolerance, and identified nine key amino acids in Bgl6 affecting the glucose-tolerance (Ki values and situmulation levels) greatly. We hypothesize that these mutations in Bgl6 caused structural changes, thus altering the location and number of glucose binding sites in the enzyme, leading to significant changes of glucose-tolerance. Based on these results, the project intends to: 1) obtain solid evidence of structural changes that are responsible for the variation of glucose-tolerance of Bgl6 by using local random mutagenesis, saturation mutagenesis, enzymatic characterizaiton and X-ray crystallography; 2) further evaluate and confirm the key role of the similar structural changes in determining the variation of glucose-tolerance with the other three β-glucosidases.The results can elucidate the molecular mechanism for glucose-tolerance, and provide more solid scientific basis for the construction of efficient β-glucosidases.

β-葡萄糖苷酶是纤维素水解的限速酶，具有葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶能显著提高纤维素转化率，但其耐受葡萄糖的分子机制尚不明晰。我们在前期研究中已获得4个葡萄糖耐受性较高的β-葡萄糖苷酶，并对其中的Bgl6进行突变，鉴定了9个影响葡萄糖耐受性的关键氨基酸位点，相关突变体的耐受能力（Ki值高低）和耐受方式（葡萄糖对酶激活作用的有无及大小）发生了显著改变。由此我们推测：这些突变使Bgl6结构发生改变，继而引起酶结合葡萄糖分子的位置与数目变化，最终导致其葡萄糖耐受性发生改变。据此，本项目拟采用局部随机突变、饱和突变和X-射线晶体学技术，结合酶学性质分析，旨在获得Bgl6结构变化引起葡萄糖耐受性改变的可靠证据，并以其它3个β-葡萄糖苷酶作为验证对象，进一步评价和证实类似结构变化对葡萄糖耐受性改变所起的关键作用。本项目有望阐明葡萄糖耐受性的分子机制，为构建性能优良的β-葡萄糖苷酶提供更充分的科学依据。

本项目首先对β-葡萄糖苷酶Bgl6活性中心附近的氨基酸残基进行丙氨酸扫描，获得了多个葡萄糖耐受性明显改变的突变体，结合饱和突变、相关性分析、多序列比对和结构分析，提出该酶活性中心入口处G178-L185-S414-L415区域的疏水性是调控其葡萄糖耐受性的关键因素。然后，建立了一种筛选葡萄糖耐受性的高通量方法，成功将β-葡萄糖苷酶Bgl15的葡萄糖耐受性提高了52.5倍（IC50值由0.04 M 提高至1.9 M）。进一步解析了突变体的晶体结构 (PDB: 6JFP)，序列比对、结构和水通道分析及生化实验表明，V167-G171-L178区域的疏水性是调控其葡萄糖耐受性的关键因素，突变可能通过形成受体单糖结合位点和调控水通道来促进转糖基作用，最终提高其葡萄糖耐受性。Bgl15的G171-L178区域与Bgl6的G178-L185区域相对应，葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶Ks5A7对应区域的残基组成也符合上述规律。随后，解析了β-葡萄糖苷酶Bgl1317的晶体结构 (PDB: 6IER)，发现L188A和A262S使其IC50值从0.8 M提高至1.5 M。该酶没有葡萄糖激活作用，这可能是因为Bgl1317中缺少与Bgl6中L185对应的残基，且与G178对应的残基是疏水性不强的甲硫氨酸。综上，我们推测，该区域的疏水性是调控GH1家族β-葡萄糖苷酶葡萄糖耐受性的关键因素。此外，本项目还建立了一个筛选热稳定性的高通量方法，成功将Bgl15和Ks5A7在50 ℃的半衰期提高225倍和8640倍。通过本项目的研究，建立了葡萄糖耐受性和热稳定性的高通量筛选方法，获得了性质更优良的突变酶，揭示了调控葡萄糖耐受性的分子机制和关键因素，丰富了β-葡萄糖苷酶结构-功能关系的认知，可为该类酶的分子改造提供理论指导，具有重要的理论意义和广阔的应用前景。