抗肿瘤新靶点鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白的发现及作用机制初步研究

鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白(OAZ)的低表达与细胞增殖、肿瘤侵袭和转移相关基因的表达有关，是治疗肿瘤的非常有潜力的靶点。我们发现提高OAZ的程序性核糖体移码表达效率可以显著降低细胞内多胺水平，进而抑制细胞增殖。. 本课题拟首先应用双荧光素报告基因载体，以5-FU为工具药检测其对OAZ移码移码表达效率的影响；然后分析调控细胞内源性OAZ移码表达效率后所导致的鸟氨酸脱羧酶、精胺/精脒N1－乙酰转移酶及精胺氧化酶活性、多胺水平、细胞凋亡、细胞增殖改变的连锁效应；再检测5-FU是否能够掺入到rRNA及对其转录后修饰、 核糖体组装和多聚核糖体的影响。从而，阐明上调OAZ移码效率的抗肿瘤生物学机制以及建立以OAZ程序性核糖体移码作为靶点进行抗肿瘤药物筛选的模型。这一从分子水平，到细胞水平，最终到临床应用的综合研究与应用，将为新药开发和临床应用预测提供全面的理论基础。

鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白(OAZ)的低表达与细胞增殖、肿瘤侵袭和转移相关基因的表达有关，是治疗肿瘤的非常有潜力的靶点。本课题首先应用含有OAZ移码元件的双荧光素酶报告基因质粒转染细胞，然后应用尿嘧啶和5-FU分别处理细胞，发现5-FU组Rluc/Fluc比值明显升高，说明5-FU可以显著提高OAZ移码移码表达效率；在低于临床常规治疗浓度100倍的条件下，也可以取得非常好的上调OAZ移码效率的结果。然后分别应用Uracil和5-FU处理细胞，检测细胞内OAZ mRNA和蛋白水平的改变，发现5-FU对OAZ的mRNA丰度无显著影响，但是，OAZ蛋白表达量显著上升。采用Badolo等开发的分光光度测定的方法，检测细胞内ODC酶活性，发现5-FU上调了OAZ移码表达效率的同时，多胺合成的限速酶ODC活性明显下降。低于临床常规治疗浓度100倍的条件下，也可以取得了非常好的抑制ODC的效果。采用反相高效液相色谱法，检测细胞内多胺，发现在低于临床常规治疗浓度100倍的条件下，也可以取得非常好的抑制多胺合成的效果。通过MTS法分析细胞增殖活性，发现5-FU对细胞增殖活性有很大抑制作用。为了探讨机制，应用U5-FU处理细胞，然后将32P-正磷酸盐加入到培养基中标记rRNA，然后提取总RNA，通过琼脂糖胶分离，回收18S和28S rRNA。应用核酸酶P1将rRNA消化成单个核苷酸，然后通过2D-TLC的方法将各种不同的核苷酸分离出来。结果证实5-FU可以成功地掺入到rRNA中。5-FU能够掺入到成熟rRNA中，从而减少尿嘧啶向假尿嘧啶核苷转化的比例。最后，裂解细胞，分离胞质，采用蔗糖梯度离心的方法，分析多聚核糖体和核糖体亚基的沉降图谱。发现5-FU还改变了核糖体的组装和多聚核糖体的数量。多方面的因素导致了翻译的忠实性和速度发生了改变，从而提高了 OAZ程序性核糖体移码的效率。为了进一步验证体内改变，以手术标本为研究对象，定量PCR方法检测ODC和OAZ的mRNA；检测细胞内ODC酶活性； Western Blot方法检测OAZ和ODC的蛋白表达。结果与细胞水平结果一致。综上，本课题建立了以OAZ程序性核糖体移码作为靶点进行抗肿瘤药物筛选的模型并阐明了上调OAZ移码效率的抗肿瘤生物学机制。这一从分子水平，到细胞水平，最终到临床应用的综合研究与应用，将为新药开发和临床应用预测提供全面的理论基础