运用反向疫苗学技术筛选布鲁氏菌的保护性抗原

本项目运用反向疫苗学的思路，结合免疫蛋白质组、gateway高通量蛋白表达、蛋白芯片抗体谱以及ELIspot细胞免疫分析等技术方法，首先通过外膜蛋白质组和免疫蛋白质组的方法发现具有免疫原性的蛋白，然后高通量表达纯化这些免疫原性蛋白，并通过芯片抗体谱分析这些蛋白诱导抗体产生的规律，用纯化的蛋白刺激免疫后的细胞，分析蛋白的细胞免疫诱导功能，通过免疫保护效果评价，最终筛选到具有免疫保护作用的抗原，为新型疫苗的研发奠定基础。

本研究按照任务书计划要求，首先采用蛋白质组技术，鉴定了布鲁氏菌的外膜蛋白和分泌蛋白，选取重要的外膜蛋白、分泌蛋白和毒力相关蛋白共计160个蛋白，采用gateway克隆技术，对这些蛋白的基因进行了重组表达载体的构建，并进行了诱导表达，成功获得了其中107个布鲁氏菌的重组蛋白。用疫苗株S19免疫小鼠，获得免疫后小鼠的脾细胞，用纯化的重组蛋白进行刺激，分析刺激后细胞上清中IFN-γ的分泌，发现其中20个蛋白能够刺激免疫后小鼠脾细胞分泌IFN-γ，表明这些蛋白能够诱导小鼠产生T细胞免疫。为分析细胞的体液免疫特性，利用纯化的蛋白，构建了布鲁氏菌的蛋白芯片，并与牛、羊的感染血清、患者血清和疫苗株免疫后的血清进行反应，鉴定诱导产生抗体的蛋白，结果显示，有至少57个有免疫原性的蛋白，其中26个至少在3种血清中有抗体。选取诱导产生细胞免疫和体液免疫的蛋白，免疫小鼠，然后用强毒株攻击，观察蛋白的保护性。选取了16个蛋白进行保护性分析，其中6个蛋白能够诱导产生保护力，提供对强毒株544攻击的保护，其中4个蛋白（BMEI0357、BMEI0705、BMEI1692和BMEII1112）为新发现的具有保护作用的蛋白，可作为后续亚单位疫苗研究的靶标。