内蒙东部区布鲁氏菌流行病学调查及分子标记疫苗研究

Bacteria of the genus Brucella are responsible for brucellosis. It is a disease that is found worldwide and affects a wide variety of mammals including field ruminants, humans, and marine mammals. This study was undertaken in order to evaluate the effect of brucellosis in Source of infection, epidemic characteristics, epidemic the form and regional distribution. The access to raw data,epidemic characteristics survey and etiological diagnosis were used in the diagnosis of brucellosis.This study design genus-specific primer and Taqman probe based on BCSP31 gene encoding31Kd antigenic protein real time fluorescence quantitative PCR reaction system and reaction condition. And then, Construction and primary analysis of BP26 tagging strains .Live attenuated vaccine S19 was selected for modification and BP26 was chosen as the target gene. By using homologous recombination,BP26 gene was replaced by resistance gene to construct tagged strain. Based on the sequence differences between the wild type strain and tagged strain, a diagnostic method was developed to differentiate immunization and infection. By these means, we can improve immunization protection efficient for one hand, and also lay the foundation for the development of weak toxicity, security performance to Brucella live vaccine.

布鲁氏菌病是一种在世界范围内都有广泛流行的危害严重的人畜共患病。本课题主要通过原始资料查阅、流行特点调查、临床症状观察以及病原学诊断对牛布鲁氏菌病的传染源、传播途径、流行形式、流行区域分布等进行调查与分析。以布鲁氏菌基因组编码31kDa核周质蛋白的OMP31基因设计了布鲁氏菌属荧光定量PCR特异性引物和Taqman荧光探针，优化荧光定量PCR反应体系和条件，建立布鲁氏菌属荧光定量PCR检测方法。最后以S19为亲本株，采用基因打靶的技术，对S19株的BP26基因定向的改造，构建使其毒力基因缺失的疫苗株。最终为构建用血清学方法能区分免疫的动物与自然感染的动物，毒力弱、安全性能好的布鲁氏菌活疫苗奠定基础。

布鲁氏菌属现已确定分为7个种20个生物型（传统分类为6个种19个型）。布鲁氏菌不同种型菌株具有不同的毒力，甚至同种型的不同菌株其毒力大小也有很大差异。布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，具有比较独特的胞内生存机制和免疫机制。深入探讨布鲁氏菌的胞内生存机制和免疫保护机制，对布鲁氏菌的胞内生存机制和免疫保护机制，对布鲁氏菌致病机制的理解、免疫保护机制以及新型疫苗的研发等具有重要意义。外膜蛋白在稳定细菌外膜的结构、适应胞内外环境和抵抗胞内杀菌机制等方面起着重要作用，与细菌的毒力有密切关系。外膜蛋白位于细菌的表面，容易被免疫系统识别，在与宿主的相互作用中发挥作用。. 项目实施和完成的主要内容:（1）内蒙古东部地区呼伦贝尔市、锡林郭勒盟、通辽市、赤峰市、兴安盟的散养户牛群、规模场牛群及屠宰场牛群流行病学调查。（2）通过运用分子生物学手段克隆OMP31基因至T载体，转入感受态细胞JM109进行测序和酶切鉴定。同时制作阳性质控标准品，并对荧光定量PCR条件进行优化，做出标准曲线。进行分析评价。（3）以S19为亲本株，采用基因打靶的技术，对S19株的BP26基因定向的改造，对疫苗株进行鉴定、一般生物学测定、毒力测定、免疫原性和保护率研究及遗传稳定性测定。. 拓展研究内容与结果：（1）布鲁菌外膜蛋白Omp22基因克隆测序及生物信息学分析。（2）牛布鲁氏菌Omp22基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定。（3）Omp22与牛布鲁氏菌感染后的巨噬细胞蛋白互作的研究。. 本研究项目是国内外首次对通过对内蒙古东部区牛布病的流行病学调查，掌握其流行规律。提出防制对策及方法，制定出可行的防制计划；并重点研究了布鲁菌外膜蛋白Omp22，对布鲁氏菌Omp22基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定；为了更好的为今后分子疫苗的研制，我们还对Omp22与牛布鲁氏菌感染后的巨噬细胞蛋白互作进行研究。本研究的开展，为布病的预防和调控、为分子疫苗的研究奠定坚实的基础。