补肾法重建和维持机体稳态的基因组甲基化机制

我们的研究显示补肾药具有撤药后远期疗效，并发现补肾能特异调节下丘脑-垂体-肾上腺-淋巴细胞轴上相关基因的表达，补肾药撤退后这些基因的表达水平能否维持？上述均涉及补肾中药重建和维持机体稳态的机制。基因甲基化是国际表观遗传学研究前沿，甲基化使基因表达沉默或降低；去甲基化则使基因表达重新激活。两者所致基因表达改变在撤除了外界干预也长时间维持，故基因甲基化水平能探测基因表达维持情况及机制。.本项目在衰老大鼠肾虚证模型，分别在补肾干预后、撤补肾药1周、1月、3月，检测大鼠认知、神经内分泌免疫等，明确撤药后药效维持时间；取下丘脑等组织，采用MeDIP芯片技术检测基因组甲基化水平，筛选被补肾药显著调节、而在撤药过程中甲基化水平不变的基因，并检测其mRNA表达，以撤药1个月以上甲基化和mRNA表达水平均维持不变的基因为补肾法重建和维持稳态的关键基因。本项目为首次对"证"的稳态重建及维持进行深入解析。

本项目首先在自然衰老肾虚模型观察了补肾药物是否具有重建稳态的作用发现补肾药能提高血浆IGF-1、DHEA、GH的水平，对皮质酮、雄激素的血浆水平没有显著影响；能降低血甘油三酯。撤除补肾药后仅升高的IGF-1仍维持，其它生化指标撤药后恢复，反映补肾药对IGF-1的作用具有长期效果。通过基因表达谱研究我们发现补肾药物能显著调节，且撤退后其表达不会恢复的基因11个，采用甲基化芯片发现其中3个发生了DNA甲基化改变，但和IGF-1长期升高之间的关系还需要研究；同时对基因表达数据的挖掘中发现随着衰老的加剧（增龄），不同组织间基因表达谱的关联下降，补肾药能重建此关联，但撤药后大范围的关联重建没有发现。自然衰老肾虚模型常混杂脾虚、血瘀等情况，因此我们决定在肾阳虚模型观察上述作用，但传统的糖皮质激素肾阳虚模型，激素停用后，动物下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴功能抑制迅速恢复，本身不能稳定，故此我们首先改进了该模型。借鉴“久病及肾”的思路，改进的方法采用长期低剂量饮水给予糖皮质激素（模拟慢性应激），结果动物出现24小时尿量增多、生殖功能降低等肾虚的典型表型，尤其动物的HPA轴功能在撤激素后仍稳定低下，并筛选到了“HPA轴功能低下稳态”备选基因（被糖皮质激素上调或下调，撤激素后表达不能恢复），该具有稳态特征（HPA轴功能稳定低下）的肾阳虚模型为以后进行补肾药的重建稳态作用研究奠定了基础。通过该项研究我们获得了一些重要发现；提出并深入阐释了把证候看做相对稳态进行研究的价值和意义；建立了具有稳态特征的新的肾阳虚证动物模型。