桃CHI基因启动子区一个插入片段参与调控叶片花青素合成的机制研究

在已克隆桃PpMYB10基因家族，并在CHI基因启动子区分离到一段长度为589bp与叶色共分离DNA序列的基础上，一方面进一步鉴定桃PpMYB10基因家族成员与结构基因在叶片中表达水平的同步性，以及在红、绿叶等不同品种叶片中的表达差异，分析MYB基因表达与叶片花青素合成之间的一致性，鉴定调控叶片花青素合成特异PpMYB10成员。另一方面，运用酵母单杂交技术分析PpMYB10基因家族成员与CHI基因启动子区插入片段之间的互作情况，利用EMSA凝胶阻滞技术鉴定插入片段中与PpMYB10结合的核心序列，并采用双荧光素酶技术分析CHI基因启动子区589bp片段插入/缺失对基因表达的影响。此外，采用烟草叶片和桃幼叶瞬时表达方法鉴定PpMYB10基因功能。通过上述研究明确PpMYB10家族成员与CHI基因启动子区插入片段核心序列的相互作用，阐明桃红叶突变性状形成的机制，开辟调控果树花青素合成新手段。

控制桃叶色的Gr基因位于第6连锁群，根据转录组数据分析确定PpMYB10.4为候选基因。通过对桃PpMYB10基因家族成员与花青素代谢途径结构基因在叶片中表达水平的同步性，以及它们在红、绿叶等不同品种叶片中的表达差异的鉴定，表明PpMYB10.4基因的表达水平的高低与叶片花青素含量、叶片花青素代谢结构基因的表达量变化高度一致。同时通过PpMYB10.4基因在烟草叶片和桃幼叶瞬时表达转化实验进一步验证其功能，PpMYB10.4基因在烟草和桃幼叶中超量表达不仅能提高叶片中花青素代谢结构基因的表达量，且能使叶片变红，确认PpMYB10.4为桃PpMYB10基因家族成员中控制叶色的主效基因。桃PpMYB10基因家族成员的进化分化表明其家族为调控花青素代谢的MYB家族，PpMYB10.4与控制果肉着色的PpMYB10.2在七千万年前发生了功能分化，由PpMYB10.4调控营养器官花青素的表达，而PpMYB10.2调控生殖器官的花青素的表达。综上所述，定位于第6连锁群的Gr基因即为PpMYB10.4，主效调控桃叶色。这部分研究成果已经整理成文发表在《BMC Plant Biology》《Tree Genetics & Genomes》和《Acta Horticulturae》。. 本研究还在红叶桃中分离到一个长度为589bp的转座子hAT，hAT位于花青素代谢途径的结构基因PpCHI基因启动子区，它的存在与桃红叶性状共分离。本研究运用酵母单杂交技术分析PpMYB10基因家族成员与hAT的互作情况，并采用双荧光素酶技术分析hAT的插入/缺失对花青素结构基因表达的影响，发现hAT能与PpMYB10基因家族成员互作，且它在PpCHI基因启动子的插入能导致PpCHI基因极显著的上升表达，通过提高桃叶片花青素的积累，进而改变叶色。本研究阐明了桃红叶突变性状形成的机制，开辟调控果树花青素合成新手段。这部分研究成果已经完成文章的撰写，正在投稿中。